桦菌芝多糖的纯化以及活性研究(附件)
摘 要桦菌芝为多孔菌科层孔菌属大型真菌,又称木蹄(木蹄层孔菌)。多年生,多生于阔叶树干上。在我国东北、西南和西部等地区分布较广。药用有消积化瘀作用,其味微苦,性平。桦菌芝(木蹄)作为民间药物历史悠久,在治疗食道癌、胃癌、子宫癌等疾病上有着显著疗效。其药用部位为子实体,经研讨表明,木蹄粗提物具有抗肿瘤,抗氧化,加强免疫功能等活性。有关桦菌芝有效成分的提取、纯化研究的报道较少。本课题运用大孔吸附树脂法对桦菌芝多糖的纯化工艺进行研究，采用单因素对其工艺参数进行筛选，得出其最佳纯化条件为AB-8型大孔吸附树脂作为纯化桦菌芝总多糖的最佳树脂，最优的工艺参数为:上样液浓度4.68mg .m1-1，上样液PH=5.5—6.0，上样流速1.0m1.min-1,上样量3.0BV;洗脱剂为20%乙醇，洗脱用量3BV，洗脱流速1.0ml. min-1，纯化后总多糖的纯度为47.21%，提高了23.95%。选取了两种常用体外抗氧化活性的检测方法，DPPH自由基清除、ABTS自由基清除对桦菌芝多糖抗氧化活性进行评估，结果说明桦菌芝多糖成分具备体外抗氧化的功能，且表现出明显的抗氧化活性。在上述两种抗氧化测试中，多糖的抗氧化活性随样品浓度的上升十分明显，呈浓度依赖关系且活性较好。本课题的研究结论为桦菌芝资源的进一步开发利用提供了科学依据，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
目 录
1绪 论 1
1.1 研究的背景 1
1.2研究的意义 1
1.3桦菌芝的概述 2
1.3.1 生物学特征及分布 2
1.3.2桦菌芝化学成分 2
1.3.3桦菌芝药理作用 3
1.4多糖研究现状 3
1.5大孔吸附树脂纯化技术 4
1.5.1大孔吸附树脂简介 4
1.5.2大孔吸附树脂在多糖纯化中的应用 5
1.6抗氧化剂及常用的体外抗氧化测定方法 5
1.6.1抗氧化剂简介 5
1.6.2常用的体外抗氧化测定方法 6
2 实验部分 7
2.1 试药与仪器 7
2.2桦菌芝多糖的提取 7
2.2.1供试品溶液的制备 7
2.2.2对照 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
品溶液的制备 7
2.2.3最大吸收波长的确定 7
2.2.4 标准曲线的绘制 8
2.3桦菌芝多糖的纯化工艺 9
2.3.1树脂的预处理与装柱 9
2.3.2树脂型号的考察 9
2.3.3 pH值对AB8树脂吸附的影响 10
2.3.4泄露曲线考察 10
2.3.5树脂柱的径高比考察 11
2.3.6洗脱剂的选择 11
2.3.7 水洗用量的选择 12
2.3.8 20%乙醇洗用量的选择 12
2.4 验证性实验 13
3 桦菌芝多糖体外抗氧化活性的评估 15
3.1多糖样品的制备 15
3.2 DPPH自由基清除实验 15
3.3 ABTS自由基清除实验 15
3.3.1 DPPH自由基清除活性 15
3.3.2 ABTS自由基清除活性 16
结 论 17
参考文献 18
致 谢 21
1绪 论
1.1 研究的背景
多糖(Polysaccharides)是人体必需的生物大分子之一，对人体健康有着非常重要的作用。又被称为多聚糖，指10个以上单糖残基由糖苷键相连而成的聚合体。多糖是大多数传统中草药的主要成分之一[1]，中草药多糖多为复合型多糖，具有特异且多样的生物活性。多糖的免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗病毒、保护胃肠系统等多种生物学活性逐步被证实。目前为止，大批科研工作者对中草药多糖领域的研究己取得国内外学术界的认可，取得了突出的创新性成绩。尤其对人参、黄芪、鹿茸等中药多糖的研究快速推动了我国多糖研究领域的发展。以多糖为重点的糖工程研究可能发展成为继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中的科学前沿。
同时，多糖领域的科技成果也对国民经济与社会的发展产生了较大影响。据世界卫生组织考察，在全世界范围内，有70%以上的人群处于亚健康，有资料表明，中草药的复合多糖及活性多糖不仅是提升人体免疫能力的最佳调节剂，也是是调理亚健康并使疾病患者康复的最佳调节剂，能明显改变亚健康状态，所以加强多糖运用研究及产品开发将产生很好的社会价值。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病[23]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。目前对桦菌芝的研究主要集中多糖的抗肿瘤作用及其作用机制方面，对于桦菌芝多糖等化学成分的提取、分离纯化研究以及其他化学成分的活性研究报道较少,不利于对桦菌芝多糖以及桦菌芝资源的进一步开发利用。
1.2研究的意义
多糖是桦菌芝中主要的有效成分，选择一种合适的提取纯化工艺、制备桦菌芝多糖的有效部分，是开发这一天然药物资源比较关键的一步。本课题运用大孔吸附树脂法对影响桦菌芝多糖的纯化工艺的考察大孔吸附树脂型号、吸附流速、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响等参数进行研究，同时对桦菌芝多糖的抗氧化作用进行了初步研究，其研究结果为桦菌芝资源的进一步开发利用奠定了基础。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病[4]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，多孔菌中所含的黄酮类化合物具有抗癌功效。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取、分离纯化研究以及质量标准研究的报道较少,限制了对其产品的进一步开发，不利于高附加值产品的研制。本次课题以桦菌芝为原料、以桦菌芝总黄酮类得率为指标,考察大孔吸附树脂型号、吸附流速、径高比、除杂体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响，建立大孔树脂纯化桦菌芝黄酮类成分的最佳参数纯化工艺。本实验可以用较低的成本得到含量较高的桦菌芝黄酮类化合物，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.3桦菌芝的概述
1.3.1 生物学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚35毫米，色调较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个；孢子长椭圆形，无色[4]。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西（秦巴山区）、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地，前苏联亦产[56]。
1.3.2桦菌芝化学成分
桦菌芝为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体，其化学成分主要包括菇类、普类、澎醇类、氨基酸类、以及蛋白质、有机酸、糖、脂类、色素类等[7]。王少芳[8]等人利用乙醇提取桦菌芝，石油醚和乙酸乙酯分离，经理化常数和光谱分析，鉴定出石油醚部分为麦角甾7,22二烯3酮、辅酶Q9?；乙酸乙酯部分为乙酰齐墩果酸、麦角甾醇、5α,8α环二氧麦角甾6,22二烯3β醇、白桦脂醇、麦角甾4,6,8(14),22四烯3酮。宋志伟[9]利用乙醇提取桦褐孔菌，1HNMR、13CNMR和MS鉴定出白桦脂醇、5,6二氢麦角甾醇、羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、栓菌酸、甘露醇、烟酸、3,22,25三羟基羊毛甾醇8烯。王少芳[10]等人再次从桦菌芝中分离出了5,6二甲氧基苯酞，6甲氧甲酰苯酞。
目 录
1绪 论 1
1.1 研究的背景 1
1.2研究的意义 1
1.3桦菌芝的概述 2
1.3.1 生物学特征及分布 2
1.3.2桦菌芝化学成分 2
1.3.3桦菌芝药理作用 3
1.4多糖研究现状 3
1.5大孔吸附树脂纯化技术 4
1.5.1大孔吸附树脂简介 4
1.5.2大孔吸附树脂在多糖纯化中的应用 5
1.6抗氧化剂及常用的体外抗氧化测定方法 5
1.6.1抗氧化剂简介 5
1.6.2常用的体外抗氧化测定方法 6
2 实验部分 7
2.1 试药与仪器 7
2.2桦菌芝多糖的提取 7
2.2.1供试品溶液的制备 7
2.2.2对照 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
品溶液的制备 7
2.2.3最大吸收波长的确定 7
2.2.4 标准曲线的绘制 8
2.3桦菌芝多糖的纯化工艺 9
2.3.1树脂的预处理与装柱 9
2.3.2树脂型号的考察 9
2.3.3 pH值对AB8树脂吸附的影响 10
2.3.4泄露曲线考察 10
2.3.5树脂柱的径高比考察 11
2.3.6洗脱剂的选择 11
2.3.7 水洗用量的选择 12
2.3.8 20%乙醇洗用量的选择 12
2.4 验证性实验 13
3 桦菌芝多糖体外抗氧化活性的评估 15
3.1多糖样品的制备 15
3.2 DPPH自由基清除实验 15
3.3 ABTS自由基清除实验 15
3.3.1 DPPH自由基清除活性 15
3.3.2 ABTS自由基清除活性 16
结 论 17
参考文献 18
致 谢 21
1绪 论
1.1 研究的背景
多糖(Polysaccharides)是人体必需的生物大分子之一，对人体健康有着非常重要的作用。又被称为多聚糖，指10个以上单糖残基由糖苷键相连而成的聚合体。多糖是大多数传统中草药的主要成分之一[1]，中草药多糖多为复合型多糖，具有特异且多样的生物活性。多糖的免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗病毒、保护胃肠系统等多种生物学活性逐步被证实。目前为止，大批科研工作者对中草药多糖领域的研究己取得国内外学术界的认可，取得了突出的创新性成绩。尤其对人参、黄芪、鹿茸等中药多糖的研究快速推动了我国多糖研究领域的发展。以多糖为重点的糖工程研究可能发展成为继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中的科学前沿。
同时，多糖领域的科技成果也对国民经济与社会的发展产生了较大影响。据世界卫生组织考察，在全世界范围内，有70%以上的人群处于亚健康，有资料表明，中草药的复合多糖及活性多糖不仅是提升人体免疫能力的最佳调节剂，也是是调理亚健康并使疾病患者康复的最佳调节剂，能明显改变亚健康状态，所以加强多糖运用研究及产品开发将产生很好的社会价值。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病[23]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。目前对桦菌芝的研究主要集中多糖的抗肿瘤作用及其作用机制方面，对于桦菌芝多糖等化学成分的提取、分离纯化研究以及其他化学成分的活性研究报道较少,不利于对桦菌芝多糖以及桦菌芝资源的进一步开发利用。
1.2研究的意义
多糖是桦菌芝中主要的有效成分，选择一种合适的提取纯化工艺、制备桦菌芝多糖的有效部分，是开发这一天然药物资源比较关键的一步。本课题运用大孔吸附树脂法对影响桦菌芝多糖的纯化工艺的考察大孔吸附树脂型号、吸附流速、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响等参数进行研究，同时对桦菌芝多糖的抗氧化作用进行了初步研究，其研究结果为桦菌芝资源的进一步开发利用奠定了基础。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病[4]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，多孔菌中所含的黄酮类化合物具有抗癌功效。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取、分离纯化研究以及质量标准研究的报道较少,限制了对其产品的进一步开发，不利于高附加值产品的研制。本次课题以桦菌芝为原料、以桦菌芝总黄酮类得率为指标,考察大孔吸附树脂型号、吸附流速、径高比、除杂体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响，建立大孔树脂纯化桦菌芝黄酮类成分的最佳参数纯化工艺。本实验可以用较低的成本得到含量较高的桦菌芝黄酮类化合物，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.3桦菌芝的概述
1.3.1 生物学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚35毫米，色调较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个；孢子长椭圆形，无色[4]。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西（秦巴山区）、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地，前苏联亦产[56]。
1.3.2桦菌芝化学成分
桦菌芝为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体，其化学成分主要包括菇类、普类、澎醇类、氨基酸类、以及蛋白质、有机酸、糖、脂类、色素类等[7]。王少芳[8]等人利用乙醇提取桦菌芝，石油醚和乙酸乙酯分离，经理化常数和光谱分析，鉴定出石油醚部分为麦角甾7,22二烯3酮、辅酶Q9?；乙酸乙酯部分为乙酰齐墩果酸、麦角甾醇、5α,8α环二氧麦角甾6,22二烯3β醇、白桦脂醇、麦角甾4,6,8(14),22四烯3酮。宋志伟[9]利用乙醇提取桦褐孔菌，1HNMR、13CNMR和MS鉴定出白桦脂醇、5,6二氢麦角甾醇、羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、栓菌酸、甘露醇、烟酸、3,22,25三羟基羊毛甾醇8烯。王少芳[10]等人再次从桦菌芝中分离出了5,6二甲氧基苯酞，6甲氧甲酰苯酞。
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