桦菌芝挥发油的超声提取工艺优化及其gcms分析(附件)
摘 要 桦菌芝在我国资源相对广泛，民间常用作抗癌药物。目前，其研究主要集中在多糖的抗肿瘤作用及作用机制方面，对于其他成分提取分离、药理作用、质量标准等研究较少，限制了桦菌芝资源的进一步开发利用。本文以桦菌芝挥发油组分为研究对象，以研究桦菌芝挥发油超声辅助提取最佳工艺条件为目标，在单因素试验的基础上采用Box-Behnken响应面法以液料比、提取时间、和超声频率三个因素优化其工艺参数，采用气相色谱-质谱联用技术对超声辅助提取的桦菌芝挥发油化学成分进行分析。研究结果表明，各因素对挥发油提取率的影响顺序为超声频率（C）>料液比（A）>提取时间（B），最佳工艺数料液比1:15g/mL，提取时间10 min，超声频率60KHz，在此条件下，桦菌芝挥发油的提取率为2.03%。与传统提取方法相比，超声辅助提取具有效率高、提取时间短、工艺简单等优势。GC-MS分析鉴定出桦菌芝中有化合物12个，主要为烯烃类，分别为β-月桂烯、柠檬烯、顺式罗勒烯、γ-松油烯、爱草脑、茴香脑、β-波旁烯、β-榄香烯、反式石竹烯、律草烯。通过GC-MS分析其挥发油组成，为了解该药物的化学成分和进一步开发研究提供有用的资料。
Key words: Pyropolyporus; Volatile oil; Assisted extraction; GCMS analysis 目 录
1绪论 1
1.1立项背景及研究意义 1
1.2 桦菌芝概述 1
1.2.1植物形态及资源分布 1
1.2.2有效成分研究 1
1.3挥发油概述及研究现状 3
1.3.1概述 3
1.3.2化学组成成分[13] 3
1.3.3挥发油的提取方法简介 4
1.4 GCMS技术简介 6
1.4.1 GCMS概述 6
1.4.2 GCMS原理 6
1.4.3 GCMS在挥发性成分以及中药有效成分中的应用 6
2 桦菌芝挥发油的提取工艺研究 7
2.1实验材料及仪器 7
2.1.1实验材料 7
2.1.2主要仪器 7
2.2 实验方法 7
2.2.1提取溶剂的选择 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
7
2.2.2 桦菌芝挥发油单因素实验方法 8
2.2.3桦菌芝挥发油提取工艺的响应曲面优化法 8
2 .3结果与分析 8
2.3.1提取溶剂的选择结果 8
2.3.2桦菌芝提取率的影响因素 9
2.4响应曲面法优化桦菌芝挥发油提取工艺条件的确定 11
2.4.1 响应曲面分析因素水平的选取及实验设计 11
2.4.2响应面数值分析结果 12
2.4.3响应曲面分析与优化 13
2.5验证性实验及结论 15
2.5.1实验性实验 15
2.5.2小结 16
3 桦菌芝挥发油的GCMS分析 17
3.1仪器与试药 17
3.1.1仪器 17
3.1.2试药 17
3.2方法 17
3.2.1静态顶空提取 17
3.2.3 IR值测定 17
3.3结果及结论 18
结论 21
参考文献 23
致谢 26
1绪论
1.1立项背景及研究意义
随着社会发展，人类平均寿命有了很大提高，而各种疾病成了影响人类寿命的重要因素，其中肿瘤发病率更是日益增高，癌症已经成为导致死亡的主要原因，在化学疗法中许多的治疗药物出现了耐药性，利用药用真菌治疗癌症已经由来已久，药用真菌生长过程中会产生许多代谢产物，而其中的一些代新产物可以干涉癌症发展，从而直接用于癌症治疗。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦。水煎服治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用，民间用于治疗胃癌、子宫癌、食道癌等病。目前对桦菌芝的研究主要集中多糖的抗肿瘤作用及其作用机制方面，对于桦菌芝其他化学成分的提取分离纯、活性研究、质量标准研究报道较少,不利于对桦菌芝多糖以及桦菌芝资源的进一步开发利用。本课题采用超声工艺优化桦菌芝挥发油提取工艺，采用气质联仪分析挥发油的组成，对桦菌芝中有效成分的研究具有深远的理论价值和实际意义。
1.2 桦菌芝概述
1.2.1植物形态及资源分布
桦菌芝为多孔菌科褐层孔菌属真菌桦菌Pyropolyporus fomentarius(Lex Fr ) Teng.以菌体入药。6~7月采集，晒干。担子果木生，多年生，无柄。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳及环状棱纹，菌肉栓质，锈褐色，菌管多层，层次不甚明显，每层厚35毫米，色较菌肉浅，管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个，孢子长椭圆形，无色。
桦菌芝多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。我国大部分省区皆有分布，如黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南等地。
1.2.2有效成分研究
桦菌芝资源十分丰富，但目前对于桦菌芝药理作用机制及化学成分研究并不多，对于桦菌芝化学成分研究的报道少之又少，大多趋向于其有效成分多糖抗肿瘤机制的研究，对桦菌芝挥发油的生物活性和药理功效已仅有一些初步研究。在1990年有桦菌芝麦角甾醇及乙酰齐墩果酸的研究，桦菌芝的现代研究表明，桦菌芝中含有多种氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸，这三种必须氨基酸含量大于1%，其中组氨酸含量最高[1] ，同时桦菌芝挥发油的研究考证更能够使桦菌芝丰富的药材资源得到进一步的利用。
1.2.3药理作用研究
1.2.3.1 抗肿瘤作用
当然桦菌芝作抗肿瘤的药材，不可避免的引起了人们的重视，近年来关于抗肿瘤机制研究的报道也越来越多，国外有报道说明桦菌芝多糖对小鼠肉瘤180有抑制作用，注射液能增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。[2] 并且中药多糖具的抗肿瘤作用没有其他肿瘤疗化药物的毒副作用。[3]刘量等人研究木蹄层孔菌子实体乙醇提取物，并发现EEF对肿瘤生长有明显抑制、对荷瘤鼠生存天数可以延长。陆勇芹[4]等人采用MTT法研究木蹄层孔菌子实体不同溶剂提取物的抗肿瘤活性，并得出木蹄层孔菌子实体的抗肿瘤活性是氯仿和乙酸乙酯提取物。张艳华[5]从桦菌芝乙醇提取乙酸乙酯成分及桦菌芝乙醇提取物氯仿组分抑制肿瘤细胞生长极其机制研究，来研究桦菌芝PFEAF抑制K562增殖的机制，结果表明，桦菌芝乙醇提取物乙酸乙酷组分提取物和乙醇提取物氯仿组分都能够抑制肿瘤细胞K562的增殖，更重要的是，桦菌芝PFEAF提取物对K562细胞的细胞毒作用是选择性的，对正常细胞没有抑制增殖能力。桦菌芝乙醇提取物石油醚组分能抑制荷瘤小鼠上S180肉瘤的生长，同时，对免疫器官没有大的毒性伤害。
1.2.3.2 增强免疫功能
宋高臣[6]等人研究桦菌芝多糖抗肿瘤作用及其免疫学机制。通过实验表明桦菌芝多糖能够抑制HepA小鼠肿瘤生长，增加免疫器官重量，促进体内L2的产生，提高小鼠单核吞噬细胞功能，说明桦菌芝多糖作为生物诱导剂能够增强荷瘤小鼠的免疫功能，从而起到抗肿瘤作用。
1.2.3.3 耐缺氧
毛慧慧[7]等人研究多孔菌属灵芝提取物GLPP，并发现GLPP对培养乳大鼠心肌细胞缺氧，复氧，H/R损伤有保护作用。徐济量[8]等人研究多孔菌属灵芝提取物与虫草合剂对小老鼠的耐缺氧作用，并发现多孔菌提取物对小老鼠有耐缺氧作用，一定程度上可以提高小鼠耐缺氧能力。
Key words: Pyropolyporus; Volatile oil; Assisted extraction; GCMS analysis 目 录
1绪论 1
1.1立项背景及研究意义 1
1.2 桦菌芝概述 1
1.2.1植物形态及资源分布 1
1.2.2有效成分研究 1
1.3挥发油概述及研究现状 3
1.3.1概述 3
1.3.2化学组成成分[13] 3
1.3.3挥发油的提取方法简介 4
1.4 GCMS技术简介 6
1.4.1 GCMS概述 6
1.4.2 GCMS原理 6
1.4.3 GCMS在挥发性成分以及中药有效成分中的应用 6
2 桦菌芝挥发油的提取工艺研究 7
2.1实验材料及仪器 7
2.1.1实验材料 7
2.1.2主要仪器 7
2.2 实验方法 7
2.2.1提取溶剂的选择 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
7
2.2.2 桦菌芝挥发油单因素实验方法 8
2.2.3桦菌芝挥发油提取工艺的响应曲面优化法 8
2 .3结果与分析 8
2.3.1提取溶剂的选择结果 8
2.3.2桦菌芝提取率的影响因素 9
2.4响应曲面法优化桦菌芝挥发油提取工艺条件的确定 11
2.4.1 响应曲面分析因素水平的选取及实验设计 11
2.4.2响应面数值分析结果 12
2.4.3响应曲面分析与优化 13
2.5验证性实验及结论 15
2.5.1实验性实验 15
2.5.2小结 16
3 桦菌芝挥发油的GCMS分析 17
3.1仪器与试药 17
3.1.1仪器 17
3.1.2试药 17
3.2方法 17
3.2.1静态顶空提取 17
3.2.3 IR值测定 17
3.3结果及结论 18
结论 21
参考文献 23
致谢 26
1绪论
1.1立项背景及研究意义
随着社会发展，人类平均寿命有了很大提高，而各种疾病成了影响人类寿命的重要因素，其中肿瘤发病率更是日益增高，癌症已经成为导致死亡的主要原因，在化学疗法中许多的治疗药物出现了耐药性，利用药用真菌治疗癌症已经由来已久，药用真菌生长过程中会产生许多代谢产物，而其中的一些代新产物可以干涉癌症发展，从而直接用于癌症治疗。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦。水煎服治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用，民间用于治疗胃癌、子宫癌、食道癌等病。目前对桦菌芝的研究主要集中多糖的抗肿瘤作用及其作用机制方面，对于桦菌芝其他化学成分的提取分离纯、活性研究、质量标准研究报道较少,不利于对桦菌芝多糖以及桦菌芝资源的进一步开发利用。本课题采用超声工艺优化桦菌芝挥发油提取工艺，采用气质联仪分析挥发油的组成，对桦菌芝中有效成分的研究具有深远的理论价值和实际意义。
1.2 桦菌芝概述
1.2.1植物形态及资源分布
桦菌芝为多孔菌科褐层孔菌属真菌桦菌Pyropolyporus fomentarius(Lex Fr ) Teng.以菌体入药。6~7月采集，晒干。担子果木生，多年生，无柄。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳及环状棱纹，菌肉栓质，锈褐色，菌管多层，层次不甚明显，每层厚35毫米，色较菌肉浅，管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个，孢子长椭圆形，无色。
桦菌芝多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。我国大部分省区皆有分布，如黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南等地。
1.2.2有效成分研究
桦菌芝资源十分丰富，但目前对于桦菌芝药理作用机制及化学成分研究并不多，对于桦菌芝化学成分研究的报道少之又少，大多趋向于其有效成分多糖抗肿瘤机制的研究，对桦菌芝挥发油的生物活性和药理功效已仅有一些初步研究。在1990年有桦菌芝麦角甾醇及乙酰齐墩果酸的研究，桦菌芝的现代研究表明，桦菌芝中含有多种氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸，这三种必须氨基酸含量大于1%，其中组氨酸含量最高[1] ，同时桦菌芝挥发油的研究考证更能够使桦菌芝丰富的药材资源得到进一步的利用。
1.2.3药理作用研究
1.2.3.1 抗肿瘤作用
当然桦菌芝作抗肿瘤的药材，不可避免的引起了人们的重视，近年来关于抗肿瘤机制研究的报道也越来越多，国外有报道说明桦菌芝多糖对小鼠肉瘤180有抑制作用，注射液能增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。[2] 并且中药多糖具的抗肿瘤作用没有其他肿瘤疗化药物的毒副作用。[3]刘量等人研究木蹄层孔菌子实体乙醇提取物，并发现EEF对肿瘤生长有明显抑制、对荷瘤鼠生存天数可以延长。陆勇芹[4]等人采用MTT法研究木蹄层孔菌子实体不同溶剂提取物的抗肿瘤活性，并得出木蹄层孔菌子实体的抗肿瘤活性是氯仿和乙酸乙酯提取物。张艳华[5]从桦菌芝乙醇提取乙酸乙酯成分及桦菌芝乙醇提取物氯仿组分抑制肿瘤细胞生长极其机制研究，来研究桦菌芝PFEAF抑制K562增殖的机制，结果表明，桦菌芝乙醇提取物乙酸乙酷组分提取物和乙醇提取物氯仿组分都能够抑制肿瘤细胞K562的增殖，更重要的是，桦菌芝PFEAF提取物对K562细胞的细胞毒作用是选择性的，对正常细胞没有抑制增殖能力。桦菌芝乙醇提取物石油醚组分能抑制荷瘤小鼠上S180肉瘤的生长，同时，对免疫器官没有大的毒性伤害。
1.2.3.2 增强免疫功能
宋高臣[6]等人研究桦菌芝多糖抗肿瘤作用及其免疫学机制。通过实验表明桦菌芝多糖能够抑制HepA小鼠肿瘤生长，增加免疫器官重量，促进体内L2的产生，提高小鼠单核吞噬细胞功能，说明桦菌芝多糖作为生物诱导剂能够增强荷瘤小鼠的免疫功能，从而起到抗肿瘤作用。
1.2.3.3 耐缺氧
毛慧慧[7]等人研究多孔菌属灵芝提取物GLPP，并发现GLPP对培养乳大鼠心肌细胞缺氧，复氧，H/R损伤有保护作用。徐济量[8]等人研究多孔菌属灵芝提取物与虫草合剂对小老鼠的耐缺氧作用，并发现多孔菌提取物对小老鼠有耐缺氧作用，一定程度上可以提高小鼠耐缺氧能力。
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