凹叶厚朴内生真菌代谢产物定量研究(附件)
摘 要凹叶厚朴属于木兰科植物，是中国特有植物，其主要活性成分是厚朴酚及和厚朴酚。长期以来，药用厚朴主要利用野生资源。内生真菌广泛存在于植物组织中，对植物不产生危害。现阶段，对厚朴内生真菌的研究主要集中在抗菌抑菌活性方面，而对其代谢产物含量的研究鲜有报道。因而本实验主要对凹叶厚朴内生真菌代谢产物进行定量研究，以弥补这一方面的空白。建立了凹叶厚朴内生真菌代谢产物中厚朴酚的高效液相色谱分析方法，对代谢产物的含量进行初步研究。通过无菌操作，运用微生物发酵方法，对分离得到的内生真菌进行液体发酵培养，提取发酵液的有效成分，以厚朴酚对照品为标准，采用HPLC测定方法。色谱条件为：流动相：甲醇-水(78:22)，柱温：25℃，检测波长：294 nm。结果，厚朴酚在进样量0.0232~0.232 μg时与色谱峰面积的线性关系良好，相关系数R2为0.999993，根据外标法测得样品的含量为0.005 mg/ml。表明该方法准确、重复性好、灵敏度高，可以用于厚朴酚的含量测定，为后续研究提供理论依据。目 录
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴 1
1.2 凹叶厚朴的酚类成分 1
1.2.1 厚朴酚 1
1.2.2 和厚朴酚 1
1.2.3 其它 2
1.3 厚朴酚、和厚朴酚的检测与分析 2
1.3.1 紫外可见分光光度法 2
1.3.2 薄层扫描法 2
1.3.3 高效液相色谱法 3
1.3.4 其它方法 3
1.4 植物内生真菌的研究 3
1.5 内生真菌产生具潜在价值的代谢产物 4
1.5.1 植物内生真菌代谢产物的产生机制 4
1.5.2 内生真菌活性代谢产物 5
1.5.3 厚朴内生真菌次生代谢产物 5
1.6 内生真菌代谢产物的提取及测定 5
1.6.1 其他植物内生真菌代谢产物 5
1.6.2 厚朴内生真菌代谢产物 7
1.7 小结 7
2 实验部分
2.1 实验材料 8
2.1.1 菌种来源 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
活性代谢产物 5
1.5.3 厚朴内生真菌次生代谢产物 5
1.6 内生真菌代谢产物的提取及测定 5
1.6.1 其他植物内生真菌代谢产物 5
1.6.2 厚朴内生真菌代谢产物 7
1.7 小结 7
2 实验部分
2.1 实验材料 8
2.1.1 菌种来源 8
2.1.2 仪器 8
2.1.3 药品及试剂 8
2.1.4 培养基的配制 8
2.2 实验方法 9
2.2.1 菌种复壮 9
2.2.2 液体发酵培养 9
2.2.3 发酵液的提取 9
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物厚朴酚的含量测定 9
2.3.1 仪器、药品与试剂 9
2.3.2 色谱条件与系统适用性试验 9
2.3.3 对照品溶液制备 10
2.4 结果与分析 10
2.4.1 线性关系考察 10
2.4.2 精密度试验 11
2.4.3 稳定性试验 11
2.4.4 重复性试验 11
2.4.5 样品的含量测定 13
2.5 分析讨论 13
结论 14
参考文献 15
致谢 18
文献综述
凹叶厚朴
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)为厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)的亚种，是现有药用植物中独特的植物之一，属于单科、单属植物，临床常用的厚朴药材，各部分均可入药，其功效有化痰、下气除满[1]。用于食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳[2]。目前在我国分布较广，产于浙江、江西、云南、四川、贵州、陕西、甘肃等地，厚朴为多年生落叶乔木，生长时间较长，供药用的需要生长十几年以上，其采集主要是砍树剥皮的方法，这使得厚朴药材和外界环境都遭到前所未有的破坏。因野生资源不断遭到破坏而日益枯竭，被列为我国珍稀植物行列[3]。
凹叶厚朴的酚类成分
厚朴酚
厚朴的提取物中含有很多成分，其中最主要的是厚朴酚，是一种联苯酚类化合物。单体为无色针状结晶，溶于苯、乙醚、氯仿、丙酮及常用的有机溶剂，难溶于水，具有脂溶性和挥发性等特性。很早的时候，人们就探索了厚朴酚的药理作用，此后对它的研究越来越多，而且把研究动物实验的结果应用于治疗相关疾病，且取得了良好的成效。国外有的学者在上世纪30年代第一次发现了厚朴酚，并对其的含量进行了测定[4]。厚朴酚具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[58]。虽然对它的研究越来越多，但是由于中药成分的复杂性、不确定性，在临床上，仍然是许多成分混合在一起，单个的应用就很少。虽然厚朴酚在某些领域的确表现出良好的临床疗效，但是只有对其单体做更深层次的基础及临床试验，才能得到国内外学者更高程度的认可，也才能使其的应用前景更为广阔[9]。
和厚朴酚
和厚朴酚是厚朴的两个有效成分之一，与厚朴酚为异构体。1973年藤田等从厚朴药材中分离得到厚朴酚及和厚朴酚，并确定了两者的结构[4]。近年来，对和厚朴酚的各种药效学研究更为深入，作用机制也更为清晰。已有大量研究报道，和厚朴酚具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[10]。同时，通过对和厚朴酚的毒理学、药物动力学和药物代谢等实验研究，都证明其适合开发成药。因此，加大对和厚朴酚的研究与开发，不仅能保护中药植物资源，体现中药潜在的价值，而且更会为人类健康带来福音，为社会带来更为深远的经济利益。
其它
厚朴除含有挥发油、生物碱等成分外，还含有多种酚类物质，占厚朴活性成分的5%[11]，一般认为，有效成分为厚朴酚与和厚朴酚。除此之外，还含有四氢厚朴酚、异厚朴酚、龙脑基厚朴酚、厚朴木脂素A~I、辣薄荷基厚朴酚、辣薄荷基和厚朴酚、厚朴三醇、丁香脂素、8,9二羟基二氢和厚朴酚等[12]。
厚朴酚、和厚朴酚的检测与分析
在厚朴的活性成分中，占有主要地位的是厚朴的酚类成分。当前，有众多方法用于两者的定量分析中。测定方法有紫外分光光度法(Visible Spectrophotpmetry,UV)、薄层扫描法(TLCS)、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管区带电泳法(CZE)。高效液相色谱法是目前为止应用最多的含量测定方法，该方法由于操作简便、专属准确、灵敏，且特异性良好而得到学者的一致认可。
紫外可见分光光度法
厚朴酚与和厚朴酚属于联苯酚类化合物，由于其具有共轭体系，所以均有较强的紫外吸收。保志娟等[13]根据这一特点，利用两者羟基质子离解性(pKa)的差异，使两者的最大吸收峰不发生重叠，再通过调节测定其pH值，利用同一波长下，吸光度的加和性，分别在289.4 nm和316.4 nm波长处测定溶液吸光度，并代入回归方程计算出厚朴酚与和厚朴酚的含量。测得其线性范围
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴 1
1.2 凹叶厚朴的酚类成分 1
1.2.1 厚朴酚 1
1.2.2 和厚朴酚 1
1.2.3 其它 2
1.3 厚朴酚、和厚朴酚的检测与分析 2
1.3.1 紫外可见分光光度法 2
1.3.2 薄层扫描法 2
1.3.3 高效液相色谱法 3
1.3.4 其它方法 3
1.4 植物内生真菌的研究 3
1.5 内生真菌产生具潜在价值的代谢产物 4
1.5.1 植物内生真菌代谢产物的产生机制 4
1.5.2 内生真菌活性代谢产物 5
1.5.3 厚朴内生真菌次生代谢产物 5
1.6 内生真菌代谢产物的提取及测定 5
1.6.1 其他植物内生真菌代谢产物 5
1.6.2 厚朴内生真菌代谢产物 7
1.7 小结 7
2 实验部分
2.1 实验材料 8
2.1.1 菌种来源 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
活性代谢产物 5
1.5.3 厚朴内生真菌次生代谢产物 5
1.6 内生真菌代谢产物的提取及测定 5
1.6.1 其他植物内生真菌代谢产物 5
1.6.2 厚朴内生真菌代谢产物 7
1.7 小结 7
2 实验部分
2.1 实验材料 8
2.1.1 菌种来源 8
2.1.2 仪器 8
2.1.3 药品及试剂 8
2.1.4 培养基的配制 8
2.2 实验方法 9
2.2.1 菌种复壮 9
2.2.2 液体发酵培养 9
2.2.3 发酵液的提取 9
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物厚朴酚的含量测定 9
2.3.1 仪器、药品与试剂 9
2.3.2 色谱条件与系统适用性试验 9
2.3.3 对照品溶液制备 10
2.4 结果与分析 10
2.4.1 线性关系考察 10
2.4.2 精密度试验 11
2.4.3 稳定性试验 11
2.4.4 重复性试验 11
2.4.5 样品的含量测定 13
2.5 分析讨论 13
结论 14
参考文献 15
致谢 18
文献综述
凹叶厚朴
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)为厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)的亚种，是现有药用植物中独特的植物之一，属于单科、单属植物，临床常用的厚朴药材，各部分均可入药，其功效有化痰、下气除满[1]。用于食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳[2]。目前在我国分布较广，产于浙江、江西、云南、四川、贵州、陕西、甘肃等地，厚朴为多年生落叶乔木，生长时间较长，供药用的需要生长十几年以上，其采集主要是砍树剥皮的方法，这使得厚朴药材和外界环境都遭到前所未有的破坏。因野生资源不断遭到破坏而日益枯竭，被列为我国珍稀植物行列[3]。
凹叶厚朴的酚类成分
厚朴酚
厚朴的提取物中含有很多成分，其中最主要的是厚朴酚，是一种联苯酚类化合物。单体为无色针状结晶，溶于苯、乙醚、氯仿、丙酮及常用的有机溶剂，难溶于水，具有脂溶性和挥发性等特性。很早的时候，人们就探索了厚朴酚的药理作用，此后对它的研究越来越多，而且把研究动物实验的结果应用于治疗相关疾病，且取得了良好的成效。国外有的学者在上世纪30年代第一次发现了厚朴酚，并对其的含量进行了测定[4]。厚朴酚具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[58]。虽然对它的研究越来越多，但是由于中药成分的复杂性、不确定性，在临床上，仍然是许多成分混合在一起，单个的应用就很少。虽然厚朴酚在某些领域的确表现出良好的临床疗效，但是只有对其单体做更深层次的基础及临床试验，才能得到国内外学者更高程度的认可，也才能使其的应用前景更为广阔[9]。
和厚朴酚
和厚朴酚是厚朴的两个有效成分之一，与厚朴酚为异构体。1973年藤田等从厚朴药材中分离得到厚朴酚及和厚朴酚，并确定了两者的结构[4]。近年来，对和厚朴酚的各种药效学研究更为深入，作用机制也更为清晰。已有大量研究报道，和厚朴酚具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[10]。同时，通过对和厚朴酚的毒理学、药物动力学和药物代谢等实验研究，都证明其适合开发成药。因此，加大对和厚朴酚的研究与开发，不仅能保护中药植物资源，体现中药潜在的价值，而且更会为人类健康带来福音，为社会带来更为深远的经济利益。
其它
厚朴除含有挥发油、生物碱等成分外，还含有多种酚类物质，占厚朴活性成分的5%[11]，一般认为，有效成分为厚朴酚与和厚朴酚。除此之外，还含有四氢厚朴酚、异厚朴酚、龙脑基厚朴酚、厚朴木脂素A~I、辣薄荷基厚朴酚、辣薄荷基和厚朴酚、厚朴三醇、丁香脂素、8,9二羟基二氢和厚朴酚等[12]。
厚朴酚、和厚朴酚的检测与分析
在厚朴的活性成分中，占有主要地位的是厚朴的酚类成分。当前，有众多方法用于两者的定量分析中。测定方法有紫外分光光度法(Visible Spectrophotpmetry,UV)、薄层扫描法(TLCS)、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管区带电泳法(CZE)。高效液相色谱法是目前为止应用最多的含量测定方法，该方法由于操作简便、专属准确、灵敏，且特异性良好而得到学者的一致认可。
紫外可见分光光度法
厚朴酚与和厚朴酚属于联苯酚类化合物，由于其具有共轭体系，所以均有较强的紫外吸收。保志娟等[13]根据这一特点，利用两者羟基质子离解性(pKa)的差异，使两者的最大吸收峰不发生重叠，再通过调节测定其pH值，利用同一波长下，吸光度的加和性，分别在289.4 nm和316.4 nm波长处测定溶液吸光度，并代入回归方程计算出厚朴酚与和厚朴酚的含量。测得其线性范围
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zygc/995.html
