克氏原螯虾视神经节小分子量多肽提取物的质谱分析
甲壳动物的视神经节是一个非常重要的神经内分泌器官，它通过控制多种神经肽类激素的合成和分泌从而参与调控一系列重要的生理活动。克氏原螯虾是一种具有重要经济价值和科学意义的代表性甲壳动物，但是有关于视神经节的研究背景还不多。本研究中，我们采用SDS-PAGE首先分离小分子量（25 kD）的视神经节多肽粗提物，并且反相高效液相色谱（RP-LC）结合电喷雾电离傅里叶变换质谱（ESI-FT MS）对肽段的质量数进行分析和鉴定。质谱结果成功鉴定28种多肽/蛋白（评分＞24），其中有12种未被蛋白鉴定分析过。进一步，这些筛选出的多肽/蛋白属于几个已知的甲壳动物神经肽类家族，如甲壳类动物心脏活性肽家族，CHH前体相关肽家族，向肌肽家族和促细胞色素激素家族等。我们的研究结果为视神经节内分泌器官及分泌的肽类激素在克氏原螯虾和其它甲壳动物的生理学研究奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 视神经节肽类粗提液的提取2
1.2.2 胶内酶切2
1.2.3 液相电喷雾傅立叶变换离子回旋共振质谱3
1.2.4 数据分析3
2 结果与分析3
2.1 克氏原螯虾视神经节小分子肽类混合液的分离3
2.2 质谱检索结果 4
3 讨论5
致谢7
参考文献7
克氏原螯虾视神经节小分子量多肽提取物的质谱分析
引言
引言：甲壳动物眼柄视神经节X器官窦腺复合体（XOSG complex）类似于哺乳动物的下丘脑垂体系统，是重要的神经内分泌器官。X器官（XO）位于视神经节端髓，由一群单轴突分泌肽神经细胞组成，它们的轴突汇集成束，末梢膨大并与神经胶质细胞交织形成窦腺（SG）。SG不具分泌功能，由XO神经分泌细胞合成并分泌的激素经轴突神经束运送至SG储存，随后进入血液循环[1]。迄今为止，已从多种甲壳动物眼柄XOSG中纯化和鉴定得到多种神经肽类激素，根据肽链长短和分子量的大小不同大致可分为促细胞激素家族（小于20个 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
氨基酸残基）、CHH家族（7090个氨基酸残基）等几大蛋白家族。这些神经肽类激素广泛参与调控甲壳动物的蜕皮、发育、代谢、色素反应、渗透压调节等重要生理活动[23]。因此对XOSG的研究一直是甲壳动物内分泌学研究的重点。
同时，由于神经肽类激素本身的复杂生化特征和微量分泌表达等特点，采用组织学、免疫学、离体培养技术等传统手段使得关于神经肽的分离、纯化和分子表征的研究进展缓慢，从而限制了甲壳动物内分泌学的快速发展。近年来，质谱技术在蛋白质组学领域中发挥巨大的推动作用，在研究甲壳动物内分泌肽方面也取得很大进展[45]。质谱技术是一种测量离子荷质比（电荷质量比）的分析方法，基于质谱的组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化特定细胞生命过程中的功能性分子，并可以给出蛋白质存在的分子修饰状况，同时还可以用于了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用[6]。随着质谱的发展，傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR MS）的应用使得神经肽成分分析取得新进展。与普通质谱技术相比，FTICR MS具有超高的分辨率和质量准确度，并且能根据研究目的的不同与多种不同电离源结合，其中最常用的用于电离极性有机物的电喷雾电离源（ESI）技术可以分别在正离子和负离子模式下选择性地电离复杂混合物中各种极性有机物[7]。
作为甲壳动物十足目重要代表的克氏原螯虾是我国重要的经济养殖品种[8]。本研究从克氏原螯虾视神经节中提取小分子量多肽混合物，经过反相高效液相色谱（RPLC）进行组分分离并筛选之后利用ESIFT MS技术进行分子鉴定。本研究的目的是统观和了解视神经节这种内分泌结构在克氏原螯虾机体内的多肽/蛋白质组组成模式，丰富甲壳动物神经肽类激素的种类，并为甲壳动物内分泌系统研究提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
克氏原螯虾于2015年5月初取自江苏无锡某水产市场，选取体质健壮、活动力强、附肢完整的成虾，不分性别，体长5.0 ~ 15.0 cm，体重13.5 ~ 35.0 g。实验室条件下暂养于室内水箱中（规格：70.0 × 50.0 × 40.0 cm），箱内有水草等隐蔽物。
1.2 方法
1.2 .1视神经节肽类粗提液的提取
保持体表清洁，将其眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7% NaCl的TrisHCl缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）中解剖出视神经节（包含窦腺），在体视显微镜下剥离去除结缔组织，每1 mL缓冲液放入50个视神经节。超声波破碎（输出功率为250 W，室温，工作5s间隔5s循环30次），将破碎后的匀浆液离心15 min（4℃，12000 rpm），取上清液在8085℃下水浴5 min，使其中的非耐热蛋白受热变性而沉淀下来。所得上清液再次离心，即为克氏原螯虾视神经节多肽的粗提液。
1.2.2 胶内酶切
将提取的粗提液进行SDSPAGE电泳（12%分离胶，5%浓缩胶），考马斯亮蓝R250染色，脱色，用刀片分别将分离后的25 kD及以下区域蛋白条带切成胶粒，重复加入脱色液（50%乙腈，25 mM NH4HCO3溶液）使之脱色完全，微加热使胶粒完全干燥。
干燥胶粒加入5 mL（浓度为10 ng/μl）溶于20 mM NH4HCO3的胰蛋白酶（Roche公司，测序级）充分酶解，稍离心收集上清液，沉淀胶粒中再加2.5 % 三氟乙酸 （TFA，ACROS公司），40℃水浴1h，稍离心收集上清液。合并上清液，冷冻干燥，再用0.5% TFA混匀溶解后进行LCMS/MS鉴定分析。
1.2.3 液相电喷雾傅立叶变换离子回旋共振质谱（LCESIFT MS）
按照如下条件设置：色谱柱：uBondapakC18柱（3.9 mm × 300 mm，Waters）；柱温室温；流动相为乙腈甲醇0.6%乙酸（体积比为5:50:45），0. 6 mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的065 min，检测波长280 nm。ESIMS/MS[9]：电喷雾电离源（ESI）；正离子模式（positive mode）；扫描范围：150~2000 m/Z，喷雾电压~4.0 Kv，使用氮气作为雾化气体（广州辉骏生物有限公司）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 视神经节肽类粗提液的提取2
1.2.2 胶内酶切2
1.2.3 液相电喷雾傅立叶变换离子回旋共振质谱3
1.2.4 数据分析3
2 结果与分析3
2.1 克氏原螯虾视神经节小分子肽类混合液的分离3
2.2 质谱检索结果 4
3 讨论5
致谢7
参考文献7
克氏原螯虾视神经节小分子量多肽提取物的质谱分析
引言
引言：甲壳动物眼柄视神经节X器官窦腺复合体（XOSG complex）类似于哺乳动物的下丘脑垂体系统，是重要的神经内分泌器官。X器官（XO）位于视神经节端髓，由一群单轴突分泌肽神经细胞组成，它们的轴突汇集成束，末梢膨大并与神经胶质细胞交织形成窦腺（SG）。SG不具分泌功能，由XO神经分泌细胞合成并分泌的激素经轴突神经束运送至SG储存，随后进入血液循环[1]。迄今为止，已从多种甲壳动物眼柄XOSG中纯化和鉴定得到多种神经肽类激素，根据肽链长短和分子量的大小不同大致可分为促细胞激素家族（小于20个 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
氨基酸残基）、CHH家族（7090个氨基酸残基）等几大蛋白家族。这些神经肽类激素广泛参与调控甲壳动物的蜕皮、发育、代谢、色素反应、渗透压调节等重要生理活动[23]。因此对XOSG的研究一直是甲壳动物内分泌学研究的重点。
同时，由于神经肽类激素本身的复杂生化特征和微量分泌表达等特点，采用组织学、免疫学、离体培养技术等传统手段使得关于神经肽的分离、纯化和分子表征的研究进展缓慢，从而限制了甲壳动物内分泌学的快速发展。近年来，质谱技术在蛋白质组学领域中发挥巨大的推动作用，在研究甲壳动物内分泌肽方面也取得很大进展[45]。质谱技术是一种测量离子荷质比（电荷质量比）的分析方法，基于质谱的组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化特定细胞生命过程中的功能性分子，并可以给出蛋白质存在的分子修饰状况，同时还可以用于了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用[6]。随着质谱的发展，傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR MS）的应用使得神经肽成分分析取得新进展。与普通质谱技术相比，FTICR MS具有超高的分辨率和质量准确度，并且能根据研究目的的不同与多种不同电离源结合，其中最常用的用于电离极性有机物的电喷雾电离源（ESI）技术可以分别在正离子和负离子模式下选择性地电离复杂混合物中各种极性有机物[7]。
作为甲壳动物十足目重要代表的克氏原螯虾是我国重要的经济养殖品种[8]。本研究从克氏原螯虾视神经节中提取小分子量多肽混合物，经过反相高效液相色谱（RPLC）进行组分分离并筛选之后利用ESIFT MS技术进行分子鉴定。本研究的目的是统观和了解视神经节这种内分泌结构在克氏原螯虾机体内的多肽/蛋白质组组成模式，丰富甲壳动物神经肽类激素的种类，并为甲壳动物内分泌系统研究提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
克氏原螯虾于2015年5月初取自江苏无锡某水产市场，选取体质健壮、活动力强、附肢完整的成虾，不分性别，体长5.0 ~ 15.0 cm，体重13.5 ~ 35.0 g。实验室条件下暂养于室内水箱中（规格：70.0 × 50.0 × 40.0 cm），箱内有水草等隐蔽物。
1.2 方法
1.2 .1视神经节肽类粗提液的提取
保持体表清洁，将其眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7% NaCl的TrisHCl缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）中解剖出视神经节（包含窦腺），在体视显微镜下剥离去除结缔组织，每1 mL缓冲液放入50个视神经节。超声波破碎（输出功率为250 W，室温，工作5s间隔5s循环30次），将破碎后的匀浆液离心15 min（4℃，12000 rpm），取上清液在8085℃下水浴5 min，使其中的非耐热蛋白受热变性而沉淀下来。所得上清液再次离心，即为克氏原螯虾视神经节多肽的粗提液。
1.2.2 胶内酶切
将提取的粗提液进行SDSPAGE电泳（12%分离胶，5%浓缩胶），考马斯亮蓝R250染色，脱色，用刀片分别将分离后的25 kD及以下区域蛋白条带切成胶粒，重复加入脱色液（50%乙腈，25 mM NH4HCO3溶液）使之脱色完全，微加热使胶粒完全干燥。
干燥胶粒加入5 mL（浓度为10 ng/μl）溶于20 mM NH4HCO3的胰蛋白酶（Roche公司，测序级）充分酶解，稍离心收集上清液，沉淀胶粒中再加2.5 % 三氟乙酸 （TFA，ACROS公司），40℃水浴1h，稍离心收集上清液。合并上清液，冷冻干燥，再用0.5% TFA混匀溶解后进行LCMS/MS鉴定分析。
1.2.3 液相电喷雾傅立叶变换离子回旋共振质谱（LCESIFT MS）
按照如下条件设置：色谱柱：uBondapakC18柱（3.9 mm × 300 mm，Waters）；柱温室温；流动相为乙腈甲醇0.6%乙酸（体积比为5:50:45），0. 6 mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的065 min，检测波长280 nm。ESIMS/MS[9]：电喷雾电离源（ESI）；正离子模式（positive mode）；扫描范围：150~2000 m/Z，喷雾电压~4.0 Kv，使用氮气作为雾化气体（广州辉骏生物有限公司）。
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