磁珠分离技术的氯噻啉上转换荧光免疫分析方法的研究
氯噻啉是一种作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体的新烟碱类内吸性杀虫剂，广泛应用于防治刺吸式口器害虫，具有高效、广谱、低毒等优点。随着氯噻啉用量日渐增加，对其在农产品和环境中残留检测方法的研究也已广泛开展。其中，免疫检测分析技术在农药残留检测中的发展较快，应用也逐渐广泛起来。它具有灵敏、快速、特异性强、分析容量大、安全可靠等优点。免疫磁珠分离技术是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的富集特性相结合的一种新颖的免疫学检测技术。Fe3O4磁性纳米材料（磁珠，MNPs）和上转换荧光纳米材料（UCNPs）在分离富集效应和光学性质上有各自的优势，MNPs和UCNPs组装起来形成的复合纳米材料将同时具备两者的优势。本研究以氯噻啉农药为研究对象，首先合成出MNPs与UCNPs，基于磁分离原理，建立了氯噻啉上转换荧光免疫分析方法，并应用于农产品和环境样品中氯噻啉残留的检测分析。
目录
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 主要试剂 3
1.1.2 主要仪器 3
1.2 方法 4
1.2.1 上转换纳米材料（UCNPs）合成 4
1.2.2 上转换纳米材料（UCNPs）氨基功能化 4
1.2.3 氨基功能化Fe3O4 磁性纳米颗粒（MNPs）合成 4
1.2.4 纳米材料与氯噻啉人工抗体、抗原偶联 4
1.2.5 基于UCNPs和MNPs免疫分析 4
1.2.6 免疫分析工作条件优化 5
1.2.7 选择性评价（交叉反应） 5
1.2.8 添加回收实验 5
1.2.9 准确性验证 5
2 结果与分析 6
2.1 磁性纳米颗粒表征 6
2.2 免疫分析工作条件优化 7
2.3 灵敏度分析 8
2.4 特异性分析（交叉反应） 8
2.5 基质效应评价 9
2.6 添加回收率测定 10
2.7 准确性分析（与HPLC相关性比较） 11
3 讨论 11
致谢 12
参考文献： 13
基于磁珠分离技 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
术的氯噻啉
上转换荧光免疫分析方法的研究
引言
引言
氯噻啉是江苏省南通市江山农药化工股份有限公司自行研制开发的一种新烟碱类杀虫剂，是一种作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体的新烟碱类内吸性杀虫剂，广泛应用于广泛应用于水稻、小麦、蔬菜、烟草、果树、茶树等作物上刺吸式口器害虫的防治，如蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马、粉虱及其抗性品系，同时对鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫也有防效，尤其对水稻二化螟、三化螟的毒力比其他烟碱类杀虫剂高，，具有高效、光谱、低毒等优点。近年来，随着氯噻啉杀虫剂的广泛使用，其消极影响也越来越明显[1]。
目前，对氯噻啉残留的检测主要依赖高效液相色谱法(HPLC)。贺敏等[2]建立了水稻中氯噻啉残留的分析方法，在稻田水、茎叶、稻壳和土壤中的最低检测浓度分别为0.0004、0.01、0.02和0.005mg/kg；张丽芬[3]建立了甘蓝中氯噻啉残留的分析方法，其最低检测浓为3.2 mg/kg。仪器检测方法有稳定性好、灵敏度高、检测限低的优点，但是仪器检测方法耗时耗力，因此很难实现实现单次大批样品的检测，并且对仪器、操作人员技术要求高。因此开发高效、快速、灵敏的检测方法显得十分必要。农药残留的快速检测方法有很多，其中免疫学技术近年来发展较快，应用十分广泛。免疫学技术有快速灵敏、特异性强、分析容量大、安全可靠的特点，非常适宜于复杂基质中痕量组分的分析和现场快速检测[4]。方松、洪霞等[5,6]基于氯噻啉抗体分别建立了氯噻啉间接竞争酶联免疫分析方法（icELISA）和时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。
其中，荧光标记分析检测技术由于其特定的优势受到广泛重视，并在近些年的研究中取得迅速发展。随着荧光标记技术的发展，突光探针备受关注。上转换荧光材料（UCNPs）是一种新兴的荧光标记物，它拥有许多优点，如毒性小、化学性质稳定、无背景荧光干扰等[7]。结合磁性纳米材料（MNPs）和UCNPs在分离富集效应和光学性质上各自的优势，以此为基础进行荧光免疫分析，实现对氯噻啉的检测。
材料与方法
材料
主要试剂
氯化铁（FeCl36H2O）
上海麦克林生化科技有限公司
乙二醇
上海麦克林生化科技有限公司
无水醋酸钠
上海麦克林生化科技有限公司
1,6己二胺
上海麦克林生化科技有限公司
牛血清白蛋白（BSA, 98.0%）
北京索莱宝科技有限公司
戊二醇（25%）
国药集团化学试剂有限公司
氯噻啉抗原、抗体以及氨基功能化UCNPs在实验室内制备
其他常规化学试剂均为分析纯试剂
主要仪器
H7650 透射电子显微镜
日本Hitachi公司
F2700 荧光分光光度计
日本Hitachi公司
980nm激光源
Vector22 FTIR分光光度计
德国Bruker公司
D8 Advance X射线衍射仪
德国Bruker公司
超水波水浴锅
VM03U漩涡混合器
MS12磁性分离器
方法
上转换纳米材料（UCNPs）合成
准确称取0.2823 g Y2O3，0.1182 g Yb2O3和0.0115 g Er2O3于150mL平底烧瓶中，加入适量浓硝酸，加热至溶液完全澄清，将多余的浓硝酸蒸干，制得Ln(NO3)3。加入5.5 mL去离子水于上述蒸干的Ln(NO3)3中，超声15 min，然后在快速搅拌条件下加入1.7 mL 0.6 mol/L的柠檬酸钠溶液，形成Ln3+柠檬酸钠溶液。最后在快速搅拌下，缓慢加入25 mL 1.0 mol/L的NaF溶液，溶液逐渐变浑浊，有白色沉淀出现，滴加完毕后用NaOH溶液将上述混合液的pH值调至5，快速搅拌1 h。搅拌完毕后将其转移至不锈钢高压反应釜中，在180℃条件下反应6 h。反应结束后，自然冷却至室温，去上层液体，下层纳米颗粒分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，60℃烘干，备用。
上转换纳米材料（UCNPs）氨基功能化
基于经典的St?ber法对UCNPs表面进行氨基功能化修饰。称取40 mg上转换纳米材料于120 mL异丙醇中，超声15 min，快速搅拌30 min。将其转移至35℃恒温箱中，在搅拌条件下加入5 mL的氨水和40 mL的水，然后逐滴加入40 mL含有50 μL正硅酸四乙酯的异丙醇溶液，反应5 h。最后再逐滴加入60 mL含有400 μL（3氨丙基）3乙氧基硅烷的异丙醇溶液，反应1 h。反应结束后，将反应产物离心分离，分别用超纯水和无水乙醇各洗涤两次，60℃条件下烘干，4℃条件下贮存备用。
目录
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 主要试剂 3
1.1.2 主要仪器 3
1.2 方法 4
1.2.1 上转换纳米材料（UCNPs）合成 4
1.2.2 上转换纳米材料（UCNPs）氨基功能化 4
1.2.3 氨基功能化Fe3O4 磁性纳米颗粒（MNPs）合成 4
1.2.4 纳米材料与氯噻啉人工抗体、抗原偶联 4
1.2.5 基于UCNPs和MNPs免疫分析 4
1.2.6 免疫分析工作条件优化 5
1.2.7 选择性评价（交叉反应） 5
1.2.8 添加回收实验 5
1.2.9 准确性验证 5
2 结果与分析 6
2.1 磁性纳米颗粒表征 6
2.2 免疫分析工作条件优化 7
2.3 灵敏度分析 8
2.4 特异性分析（交叉反应） 8
2.5 基质效应评价 9
2.6 添加回收率测定 10
2.7 准确性分析（与HPLC相关性比较） 11
3 讨论 11
致谢 12
参考文献： 13
基于磁珠分离技 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
术的氯噻啉
上转换荧光免疫分析方法的研究
引言
引言
氯噻啉是江苏省南通市江山农药化工股份有限公司自行研制开发的一种新烟碱类杀虫剂，是一种作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体的新烟碱类内吸性杀虫剂，广泛应用于广泛应用于水稻、小麦、蔬菜、烟草、果树、茶树等作物上刺吸式口器害虫的防治，如蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马、粉虱及其抗性品系，同时对鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫也有防效，尤其对水稻二化螟、三化螟的毒力比其他烟碱类杀虫剂高，，具有高效、光谱、低毒等优点。近年来，随着氯噻啉杀虫剂的广泛使用，其消极影响也越来越明显[1]。
目前，对氯噻啉残留的检测主要依赖高效液相色谱法(HPLC)。贺敏等[2]建立了水稻中氯噻啉残留的分析方法，在稻田水、茎叶、稻壳和土壤中的最低检测浓度分别为0.0004、0.01、0.02和0.005mg/kg；张丽芬[3]建立了甘蓝中氯噻啉残留的分析方法，其最低检测浓为3.2 mg/kg。仪器检测方法有稳定性好、灵敏度高、检测限低的优点，但是仪器检测方法耗时耗力，因此很难实现实现单次大批样品的检测，并且对仪器、操作人员技术要求高。因此开发高效、快速、灵敏的检测方法显得十分必要。农药残留的快速检测方法有很多，其中免疫学技术近年来发展较快，应用十分广泛。免疫学技术有快速灵敏、特异性强、分析容量大、安全可靠的特点，非常适宜于复杂基质中痕量组分的分析和现场快速检测[4]。方松、洪霞等[5,6]基于氯噻啉抗体分别建立了氯噻啉间接竞争酶联免疫分析方法（icELISA）和时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。
其中，荧光标记分析检测技术由于其特定的优势受到广泛重视，并在近些年的研究中取得迅速发展。随着荧光标记技术的发展，突光探针备受关注。上转换荧光材料（UCNPs）是一种新兴的荧光标记物，它拥有许多优点，如毒性小、化学性质稳定、无背景荧光干扰等[7]。结合磁性纳米材料（MNPs）和UCNPs在分离富集效应和光学性质上各自的优势，以此为基础进行荧光免疫分析，实现对氯噻啉的检测。
材料与方法
材料
主要试剂
氯化铁（FeCl36H2O）
上海麦克林生化科技有限公司
乙二醇
上海麦克林生化科技有限公司
无水醋酸钠
上海麦克林生化科技有限公司
1,6己二胺
上海麦克林生化科技有限公司
牛血清白蛋白（BSA, 98.0%）
北京索莱宝科技有限公司
戊二醇（25%）
国药集团化学试剂有限公司
氯噻啉抗原、抗体以及氨基功能化UCNPs在实验室内制备
其他常规化学试剂均为分析纯试剂
主要仪器
H7650 透射电子显微镜
日本Hitachi公司
F2700 荧光分光光度计
日本Hitachi公司
980nm激光源
Vector22 FTIR分光光度计
德国Bruker公司
D8 Advance X射线衍射仪
德国Bruker公司
超水波水浴锅
VM03U漩涡混合器
MS12磁性分离器
方法
上转换纳米材料（UCNPs）合成
准确称取0.2823 g Y2O3，0.1182 g Yb2O3和0.0115 g Er2O3于150mL平底烧瓶中，加入适量浓硝酸，加热至溶液完全澄清，将多余的浓硝酸蒸干，制得Ln(NO3)3。加入5.5 mL去离子水于上述蒸干的Ln(NO3)3中，超声15 min，然后在快速搅拌条件下加入1.7 mL 0.6 mol/L的柠檬酸钠溶液，形成Ln3+柠檬酸钠溶液。最后在快速搅拌下，缓慢加入25 mL 1.0 mol/L的NaF溶液，溶液逐渐变浑浊，有白色沉淀出现，滴加完毕后用NaOH溶液将上述混合液的pH值调至5，快速搅拌1 h。搅拌完毕后将其转移至不锈钢高压反应釜中，在180℃条件下反应6 h。反应结束后，自然冷却至室温，去上层液体，下层纳米颗粒分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，60℃烘干，备用。
上转换纳米材料（UCNPs）氨基功能化
基于经典的St?ber法对UCNPs表面进行氨基功能化修饰。称取40 mg上转换纳米材料于120 mL异丙醇中，超声15 min，快速搅拌30 min。将其转移至35℃恒温箱中，在搅拌条件下加入5 mL的氨水和40 mL的水，然后逐滴加入40 mL含有50 μL正硅酸四乙酯的异丙醇溶液，反应5 h。最后再逐滴加入60 mL含有400 μL（3氨丙基）3乙氧基硅烷的异丙醇溶液，反应1 h。反应结束后，将反应产物离心分离，分别用超纯水和无水乙醇各洗涤两次，60℃条件下烘干，4℃条件下贮存备用。
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