辣椒疫霉效应因子rxlr48在致病中的作用初步分析
疫霉菌（Phytophthora）隶属于卵菌，可以引起植物的严重病害，被称为植物的“毁灭者”,辣椒疫霉（Phytophthora capsici）是其中一个重要的种。疫霉菌分泌大量的效应子到植物细胞干扰植物的防卫反应，其中RxLR效应子是目前研究非常广泛的胞内效应子。本实验室前期通过酵母双杂交筛选辣椒疫霉的效应因子，得到能与植物抗性相关蛋白互作的RxLR48效应因子。本研究通过PEG介导的疫霉转化技术获得了2个RxLR48的沉默因子，测定了沉默转化子的生长速率及菌落形态，两个沉默子的菌落比野生型的小得多，说明RxLR48对辣椒疫霉的生长有一定影响。再通过菌丝块接种的方法测定了效应因子RxLR48沉默转化子的致病力及菌丝定殖量，结果显示T129与T12在接种点的菌丝定殖量约为野生型的11.1%和1.6%，差异极显著，表明RxLR48效应因子对辣椒疫霉的致病性有显著影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1植物及菌株材料的获得及保存3
1.1.1供试菌株3
1.1.2供试植物3
1.2主要试剂及培养基3
1.3实验方法4
1.3.1构建载体4
1.3.2重组质粒大量提取4
1.3.3 PEG介导的辣椒疫霉原生质体转化5
1.3.3.1 辣椒疫霉的转化培养5
1.3.3.2 辣椒疫霉介导的原生质体转化步骤5
1.3.4辣椒疫霉稳定转化子筛选6
1.3.5转化子生长速率测定7
1.3.6转化子致病性检测7
2 结果与分析7
2.1 辣椒疫霉LT263菌株稳定转化子的获得7
2.2 RxLR48沉默转化子生物测定8
3讨论 9
致谢9
参考文献10 辣椒疫霉效应因子RxLR48在致病中的作用
引言
引言
卵菌(Oomycetes)属于色菌界(Chromista)，由于其形态特征和生活习性与真菌相似，通常被称为真菌；但 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
在进化地位上卵菌与真真菌相差很远，而与褐藻和硅藻有更近的亲缘关系，从而形成一个独特的二倍体微生物类群[1]。其生物学特征主要表现为细胞壁大多由纤维素构成、 营养生长阶段为二倍体、 线粒体脊为管状等[2]。卵菌可侵染农林生产上的众多植物,引致多种毁灭性病害，如大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病、致病疫霉(P. infestans)引起的马铃薯晚疫病和橡树疫霉(P. ramorum)引起的橡树猝死病等。
植物与病原体协同进化过程中，也逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵御病原物的侵染。植物中抵抗外界微生物刺激所形成的系统被称为植物天然免疫系统，可分为两个层次[3]。第1层防御系统称为病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)，它通过模式识别受体(PRRs)来识别病原相关分子模式(PAMPs)例如细菌鞭毛蛋白(flagellin)、脂多糖(LPS)、真菌的葡聚糖(glucans)、几丁质(chitins)，以迅速触发基础免疫,包括超敏(HR)反应、活性氧爆发(ROS)、植物抗毒素的产生以及一些抗病相关基因的表达。此类防御反应可以有效地抑制病原菌的生长，控制病情。然而在植物与微生物协同进化过程中，病原菌进化出一些能抑制PTI发生的机制，来躲避或干涉植物第1层防御系统，如效应因子(effectors)。病原菌将众多效应因子蛋白运送进入植物的细胞质中与宿主蛋白发生作用，抑制基础免疫响应PTI从而在植物体内积累大量病原体。针对这一情况，植物进化出应对病原菌侵袭的效应因子触发的免疫性(ETI)机制，属于植物的第2层防御系统。
其中，植物对PAMPs的识别(PR)是植物免疫的最基本过程。这种主动防御反应被定义为植物的基础抗性，也称为基础免疫。而植物产生针对性更强的抗性蛋白(R蛋白)识别病原菌的效应因子活性，并通过效应因子触发型免疫(ETI)来重建植物的抗性，其中主要涉及基因与基因之间的相互作用问题。这种主动防御被称为植物的R一基因抗性。应对ETI免疫施加的正向选择压力，病原微生物通过丢失或加速突变被识别的效应因子(无毒蛋白)，逃避ETI识别，或者进化出新效应因子直接抑制宿主ETI，恢复病原微生物侵染。针对不断变异的效应因子，植物也凭借不断进化出的新型R蛋白重新启动对病原微生物的ETI免疫。伴随着植物与病原菌二者之间的若干级联反应的出现，从而导致植物和病原菌不断产生新的选择压力, 在遗传上实现协同进化。随着对卵菌与植物互作方面研究的不断深入，发现卵菌和植物的互作也基本上符合上述理论[4]。
一直以来，卵菌在分子水平上的研究进展缓慢。最近几年随着分子生物学技术的发展，卵菌分子遗传学研究取得了较大的进展[5]。目前包括大豆疫霉、致病疫霉、拟南芥霜霉、终极腐霉、古巴假霜霉等植物病原卵菌的全基因组序列均已正式公布。与此同时，研究者们分析了多个病原疫霉菌在侵染寄主之前和侵染寄主时的转录组情况，获得了疫霉菌可能参与致病的差异表达的基因表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)信息。随着对病原菌无毒基因研究的不断深入，其编码蛋白可被携带相应抗病基因的植物识别，表现无毒功能：而不能被未携带相应抗病基因的植物识别，表现毒性功能，基于此，无毒基因也称为效应基因( effector gene ) [6]。通过生物信息学研究，植物病原卵菌拥有数百个含有编码RxLR ( R，精氨酸；x，任何氨基酸; L，亮氨酸；R，精氨酸) 保守基序的效应基因。如此众多效应基因处于快速“诞生和死亡”的变化中[7]。
在细菌、卵菌、真菌中效应因子均存在，它们可进入植物细胞内或细胞外的质外体(apoplast)。不同的效应因子在侵染过程中承担着不同的功能，有些可以保持病原菌在侵染过程中结构的完整，有些可以造成宿主的营养缺陷，有些可以帮助病原菌迅速扩散，有些可以抑制宿主的PTI,以此促进病程发展。现阶段，疫霉属中包括很多危害重要经济作物的病原菌，每个疫霉基因编码数以百计的细胞效应因子，这些效应因子被认为参与调节宿主细胞的免疫应答。然而大多数的疫霉效应因子的功能尚未被确定[8]。其中，RXLR效应基因是卵菌中研究较为清楚的一类效应基因。RxLR效应子是一类卵菌的胞内效应子，近年来越来越多的证据表明 RxLR 保守基序可以介导该类效应物蛋白转运进入植物细胞并对病原菌侵染具有至关重要的作用。
本研究克隆了辣椒疫霉效应因子RxLR48，并通过PFG介导的疫霉转化技术在辣椒疫霉中将其沉默，得到2个沉默转化子；测定了其在致病性和疫霉生长特性等方面的影响；初步明确了其参与辣椒疫霉菌侵染寄主的功能。为进一步研究RxLR48的作用机制奠定了基础。
1 材料与方法
植物及菌株材料的获得及保存
供试菌株
辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株LT263为本实验室保存，在10 %（V8+1 % CaCO3）固体培养基（1.5 % Agar powder）中于25℃培养、保存。
大肠杆菌（Eschrichia coli）DH5α也为本实验室留种保存。
供试植物
本研究所用植物材料本氏烟（Nicotiana benthamiana）于植物培养室25 ℃、16:8光暗交替条件下培养6~8周后使用。
主要试剂及培养基
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1植物及菌株材料的获得及保存3
1.1.1供试菌株3
1.1.2供试植物3
1.2主要试剂及培养基3
1.3实验方法4
1.3.1构建载体4
1.3.2重组质粒大量提取4
1.3.3 PEG介导的辣椒疫霉原生质体转化5
1.3.3.1 辣椒疫霉的转化培养5
1.3.3.2 辣椒疫霉介导的原生质体转化步骤5
1.3.4辣椒疫霉稳定转化子筛选6
1.3.5转化子生长速率测定7
1.3.6转化子致病性检测7
2 结果与分析7
2.1 辣椒疫霉LT263菌株稳定转化子的获得7
2.2 RxLR48沉默转化子生物测定8
3讨论 9
致谢9
参考文献10 辣椒疫霉效应因子RxLR48在致病中的作用
引言
引言
卵菌(Oomycetes)属于色菌界(Chromista)，由于其形态特征和生活习性与真菌相似，通常被称为真菌；但 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
在进化地位上卵菌与真真菌相差很远，而与褐藻和硅藻有更近的亲缘关系，从而形成一个独特的二倍体微生物类群[1]。其生物学特征主要表现为细胞壁大多由纤维素构成、 营养生长阶段为二倍体、 线粒体脊为管状等[2]。卵菌可侵染农林生产上的众多植物,引致多种毁灭性病害，如大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病、致病疫霉(P. infestans)引起的马铃薯晚疫病和橡树疫霉(P. ramorum)引起的橡树猝死病等。
植物与病原体协同进化过程中，也逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵御病原物的侵染。植物中抵抗外界微生物刺激所形成的系统被称为植物天然免疫系统，可分为两个层次[3]。第1层防御系统称为病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)，它通过模式识别受体(PRRs)来识别病原相关分子模式(PAMPs)例如细菌鞭毛蛋白(flagellin)、脂多糖(LPS)、真菌的葡聚糖(glucans)、几丁质(chitins)，以迅速触发基础免疫,包括超敏(HR)反应、活性氧爆发(ROS)、植物抗毒素的产生以及一些抗病相关基因的表达。此类防御反应可以有效地抑制病原菌的生长，控制病情。然而在植物与微生物协同进化过程中，病原菌进化出一些能抑制PTI发生的机制，来躲避或干涉植物第1层防御系统，如效应因子(effectors)。病原菌将众多效应因子蛋白运送进入植物的细胞质中与宿主蛋白发生作用，抑制基础免疫响应PTI从而在植物体内积累大量病原体。针对这一情况，植物进化出应对病原菌侵袭的效应因子触发的免疫性(ETI)机制，属于植物的第2层防御系统。
其中，植物对PAMPs的识别(PR)是植物免疫的最基本过程。这种主动防御反应被定义为植物的基础抗性，也称为基础免疫。而植物产生针对性更强的抗性蛋白(R蛋白)识别病原菌的效应因子活性，并通过效应因子触发型免疫(ETI)来重建植物的抗性，其中主要涉及基因与基因之间的相互作用问题。这种主动防御被称为植物的R一基因抗性。应对ETI免疫施加的正向选择压力，病原微生物通过丢失或加速突变被识别的效应因子(无毒蛋白)，逃避ETI识别，或者进化出新效应因子直接抑制宿主ETI，恢复病原微生物侵染。针对不断变异的效应因子，植物也凭借不断进化出的新型R蛋白重新启动对病原微生物的ETI免疫。伴随着植物与病原菌二者之间的若干级联反应的出现，从而导致植物和病原菌不断产生新的选择压力, 在遗传上实现协同进化。随着对卵菌与植物互作方面研究的不断深入，发现卵菌和植物的互作也基本上符合上述理论[4]。
一直以来，卵菌在分子水平上的研究进展缓慢。最近几年随着分子生物学技术的发展，卵菌分子遗传学研究取得了较大的进展[5]。目前包括大豆疫霉、致病疫霉、拟南芥霜霉、终极腐霉、古巴假霜霉等植物病原卵菌的全基因组序列均已正式公布。与此同时，研究者们分析了多个病原疫霉菌在侵染寄主之前和侵染寄主时的转录组情况，获得了疫霉菌可能参与致病的差异表达的基因表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)信息。随着对病原菌无毒基因研究的不断深入，其编码蛋白可被携带相应抗病基因的植物识别，表现无毒功能：而不能被未携带相应抗病基因的植物识别，表现毒性功能，基于此，无毒基因也称为效应基因( effector gene ) [6]。通过生物信息学研究，植物病原卵菌拥有数百个含有编码RxLR ( R，精氨酸；x，任何氨基酸; L，亮氨酸；R，精氨酸) 保守基序的效应基因。如此众多效应基因处于快速“诞生和死亡”的变化中[7]。
在细菌、卵菌、真菌中效应因子均存在，它们可进入植物细胞内或细胞外的质外体(apoplast)。不同的效应因子在侵染过程中承担着不同的功能，有些可以保持病原菌在侵染过程中结构的完整，有些可以造成宿主的营养缺陷，有些可以帮助病原菌迅速扩散，有些可以抑制宿主的PTI,以此促进病程发展。现阶段，疫霉属中包括很多危害重要经济作物的病原菌，每个疫霉基因编码数以百计的细胞效应因子，这些效应因子被认为参与调节宿主细胞的免疫应答。然而大多数的疫霉效应因子的功能尚未被确定[8]。其中，RXLR效应基因是卵菌中研究较为清楚的一类效应基因。RxLR效应子是一类卵菌的胞内效应子，近年来越来越多的证据表明 RxLR 保守基序可以介导该类效应物蛋白转运进入植物细胞并对病原菌侵染具有至关重要的作用。
本研究克隆了辣椒疫霉效应因子RxLR48，并通过PFG介导的疫霉转化技术在辣椒疫霉中将其沉默，得到2个沉默转化子；测定了其在致病性和疫霉生长特性等方面的影响；初步明确了其参与辣椒疫霉菌侵染寄主的功能。为进一步研究RxLR48的作用机制奠定了基础。
1 材料与方法
植物及菌株材料的获得及保存
供试菌株
辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株LT263为本实验室保存，在10 %（V8+1 % CaCO3）固体培养基（1.5 % Agar powder）中于25℃培养、保存。
大肠杆菌（Eschrichia coli）DH5α也为本实验室留种保存。
供试植物
本研究所用植物材料本氏烟（Nicotiana benthamiana）于植物培养室25 ℃、16:8光暗交替条件下培养6~8周后使用。
主要试剂及培养基
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