农杆菌介导水稻花粉的转基因方法研究
水稻（Oryza sativa L.）的转基因主要方法是农杆菌介导法和基因枪转化法，这两种方法都是以愈伤组织为转基因受体，通过农杆浸染或基因枪轰击，依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养的植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。但该方法存在工作量大、周期长，转基因植株的育性降低甚至丧失等缺点。本实验用转化了重组pMDC83-GhMAC3的农杆菌侵染离体培养水稻花粉，再将花粉授到去雄的籼稻9311柱头，获得了转基因T0代水稻种子。随机抽取100粒T0代水稻种子，分别对载体Hpt基因和目的基因GhMAC3进行PCR检测，Hpt阳性水稻8株，GhMAC3阳性水稻22株。该法操作简单，效率高、成本低、周期短，不需要通过组培等一系列复杂操作，具有广泛的实用价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法 4
2 结果与分析6
3 讨论9
致谢10
参考文献10
农杆菌介导水稻花粉的转基因方法研究
农学 洪佳琦
引言
引言
转基因植物(genetically modified plant，GMP) 是指利用重组 DNA 技术将克隆的优异外源基因导入植物组织并表达，从而获得的具有特定目标性状的植物。利用转基因技术可将细菌、病毒、动物、远缘植物、人类甚至人工合成的基因导入植物，可克服植物有性杂交的限制，使基因交流的范围无限扩大，对植物遗传改良有着重要影响。
1983 年，首例转基因烟草在美国问世; 1986 年，转基因植物首次获准进行田间试验; 1993 年，美国 Calgene 公司转基因延熟保鲜番茄 Flavr SavrT被农业部批准进入商业化生产种植，并于次年获准上市，开创了转基因植物商业化应用的先河。近年来，随着分子生物技术的不断进步，转基因植物研究和应用更是得到了非常迅猛的发展。据不完全统计，目前全世界已进入中试阶段的转基因植物有 35 个科、12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
0 个种，包括粮食、蔬菜、水果、林木和花卉等。转基因性状多数在抗虫、抗除草剂、抗病、抗逆、品质改良、发育调控及药物生产等方面[1]。我国共有 30 个种的转基因植物申报了安全性评价，包括转基因水稻、棉花、玉米、油菜、马铃薯、大豆、小麦等，其中转基因棉花、矮牵牛花、番茄、甜椒、白杨树和番木瓜已经商业化种植，显示了良好的产业化潜力[2]。目前， 大面积推广的转基因植物主要为转抗除草剂 抗虫基因的大田作物。自 1996 年首例转基因作物商业化种植以来，全球已累计批准 25 种转基因作物进行商业化生产，以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物已经在全球 28 个国家和地区种植，2012 年种植面积已达 1.7 亿公顷[3]。转基因生物产业已成为全球新的经济增长点，是增强农业国际竞争力的重要保障。
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，世界上近二分之一的人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为主食［4］近年来，随着世界人口增加、耕地减少，生物与非生物因素胁迫日益严重的情况下，水稻生产面临巨大挑战[5]。由于传统的育种方法主要是利用远缘杂交以及品种间杂交来提高水稻品质和产量，有限的种质资源往往限制了水稻育种工作。然而基因工程技术的发展和应用，打破了物种间的界限，增加了外源基因导入水稻的途径和范围，对水稻遗传改良有着深远意义[6]。
目前，常见的水稻转基因技术有 2 种：农杆菌介导法和基因枪法。
基因枪法又称微弹轰击法。其原理是通过高压气流的作用，金属微粒将吸附在其表面上的 DNA 带入受体细胞中，伴随而入的 DNA 分子便随机整合到寄主细胞的基因组上。这是一物理过程，基因导入一般不受基因型限制。基因枪法转化植物具有周期短、不受外植体限制的特点。植物的幼胚、成熟胚、分生组织及胚性愈伤组织等多种外植体适于基因枪法转化。该方法是我国科学家周光宇等首次提出并设计的。原理为 在授 粉 后 向子 房 注 射含 目 的 基 因 的DNA 溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源 DNA 导入受精卵细胞，并进一步被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，被应用于植物转基因的农杆菌主要有根癌农杆菌和发根农杆菌。其细胞中分别含有 Ti 质粒和Ｒi 质粒，其上有一段 T － DNA，以根癌农杆菌工程菌为介导，通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T －DNA 插入到植物基因组中。农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，也是目前双子叶植物遗传转化最常用的方法。过去人们一直认为农杆菌介导的基因转化仅仅局限于大多数双子叶植物，然而 ，近年来，由于在载体系统和转化方法研究上的进展 ,农杆菌fe7k 稻己取得了成功[7]。 1993 年，Chan 等[8]首次采用农杆菌介导法转化水稻。但是在相关报道中，由于整个研究试验设计不够严谨，研究结果缺乏可靠的分子证据，使得人们对农杆菌介导法能否应用于水稻持怀疑态度。直到1994 年，Hiei [9]等采用“双超元”载体和向共培养菌液中添加乙酰丁香酮等改进措施建立了粳稻的高频农杆菌转化体系，并从分子水平和遗传学角度证实外源基因的稳定插入、表达和遗传。至此，农杆菌介导转化水稻技术获得突破性进展并为农杆菌介导转化单子叶植物开辟了先河[6]。随着农杆菌转化体系的不断深入研究和完善, 该方法已成为水稻遗传转化的主流方法。
水稻转基因技术经过 20 多年发展己建立起农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体转化法和花粉管通道法等 10 多种遗传转化技术体系，并在提高水稻品质、产量和增加抗逆性等方面取得了很大的成就[10,1112]。目前，国内外学者普遍重视水稻农杆菌介导转化技术，农杆菌介导的水稻遗传转化方法已达到了应用的阶段并成为水稻转化的主流技术，这一方法将进一步朝着安全、高效、规模化方向发展。水稻转基因的主要方法是农杆菌介导法和基因枪转化法，这两种方法都是是以愈伤组织为转基因受体，通过农杆浸染，依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养的植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。这两种方法不仅受植物种类、基因型、外植体再生能力、农杆菌的活力等诸多因素的影响，而且存在着遗传转化成本高，工作量大、周期长，转基因植株的育性降低甚至丧失等缺点，因此需要进一步改进。非组织培养方法的转基因技术的探索与成功必将带来转基因育种新的飞跃[6]。
本研究旨在建立一种不依赖于组织培养、可以稳定、高效、适合于规模化操作的农杆菌转化水稻的新方法
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
本研究选用供试材料为籼稻9311，种植于大学江浦实验站，
1.1.2 菌株、生化试剂
有目的载体的农杆菌菌株EHA105为本实验室保存。PCR反应所用rTaq、dNTP、T4DNA连接酶购于Takara公司。卡那霉素、培养基配制所需化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 PCR引物
本实验所用PCR引物（如表1）由南京金斯瑞公司合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法 4
2 结果与分析6
3 讨论9
致谢10
参考文献10
农杆菌介导水稻花粉的转基因方法研究
农学 洪佳琦
引言
引言
转基因植物(genetically modified plant，GMP) 是指利用重组 DNA 技术将克隆的优异外源基因导入植物组织并表达，从而获得的具有特定目标性状的植物。利用转基因技术可将细菌、病毒、动物、远缘植物、人类甚至人工合成的基因导入植物，可克服植物有性杂交的限制，使基因交流的范围无限扩大，对植物遗传改良有着重要影响。
1983 年，首例转基因烟草在美国问世; 1986 年，转基因植物首次获准进行田间试验; 1993 年，美国 Calgene 公司转基因延熟保鲜番茄 Flavr SavrT被农业部批准进入商业化生产种植，并于次年获准上市，开创了转基因植物商业化应用的先河。近年来，随着分子生物技术的不断进步，转基因植物研究和应用更是得到了非常迅猛的发展。据不完全统计，目前全世界已进入中试阶段的转基因植物有 35 个科、12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
0 个种，包括粮食、蔬菜、水果、林木和花卉等。转基因性状多数在抗虫、抗除草剂、抗病、抗逆、品质改良、发育调控及药物生产等方面[1]。我国共有 30 个种的转基因植物申报了安全性评价，包括转基因水稻、棉花、玉米、油菜、马铃薯、大豆、小麦等，其中转基因棉花、矮牵牛花、番茄、甜椒、白杨树和番木瓜已经商业化种植，显示了良好的产业化潜力[2]。目前， 大面积推广的转基因植物主要为转抗除草剂 抗虫基因的大田作物。自 1996 年首例转基因作物商业化种植以来，全球已累计批准 25 种转基因作物进行商业化生产，以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物已经在全球 28 个国家和地区种植，2012 年种植面积已达 1.7 亿公顷[3]。转基因生物产业已成为全球新的经济增长点，是增强农业国际竞争力的重要保障。
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，世界上近二分之一的人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为主食［4］近年来，随着世界人口增加、耕地减少，生物与非生物因素胁迫日益严重的情况下，水稻生产面临巨大挑战[5]。由于传统的育种方法主要是利用远缘杂交以及品种间杂交来提高水稻品质和产量，有限的种质资源往往限制了水稻育种工作。然而基因工程技术的发展和应用，打破了物种间的界限，增加了外源基因导入水稻的途径和范围，对水稻遗传改良有着深远意义[6]。
目前，常见的水稻转基因技术有 2 种：农杆菌介导法和基因枪法。
基因枪法又称微弹轰击法。其原理是通过高压气流的作用，金属微粒将吸附在其表面上的 DNA 带入受体细胞中，伴随而入的 DNA 分子便随机整合到寄主细胞的基因组上。这是一物理过程，基因导入一般不受基因型限制。基因枪法转化植物具有周期短、不受外植体限制的特点。植物的幼胚、成熟胚、分生组织及胚性愈伤组织等多种外植体适于基因枪法转化。该方法是我国科学家周光宇等首次提出并设计的。原理为 在授 粉 后 向子 房 注 射含 目 的 基 因 的DNA 溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源 DNA 导入受精卵细胞，并进一步被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，被应用于植物转基因的农杆菌主要有根癌农杆菌和发根农杆菌。其细胞中分别含有 Ti 质粒和Ｒi 质粒，其上有一段 T － DNA，以根癌农杆菌工程菌为介导，通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T －DNA 插入到植物基因组中。农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，也是目前双子叶植物遗传转化最常用的方法。过去人们一直认为农杆菌介导的基因转化仅仅局限于大多数双子叶植物，然而 ，近年来，由于在载体系统和转化方法研究上的进展 ,农杆菌fe7k 稻己取得了成功[7]。 1993 年，Chan 等[8]首次采用农杆菌介导法转化水稻。但是在相关报道中，由于整个研究试验设计不够严谨，研究结果缺乏可靠的分子证据，使得人们对农杆菌介导法能否应用于水稻持怀疑态度。直到1994 年，Hiei [9]等采用“双超元”载体和向共培养菌液中添加乙酰丁香酮等改进措施建立了粳稻的高频农杆菌转化体系，并从分子水平和遗传学角度证实外源基因的稳定插入、表达和遗传。至此，农杆菌介导转化水稻技术获得突破性进展并为农杆菌介导转化单子叶植物开辟了先河[6]。随着农杆菌转化体系的不断深入研究和完善, 该方法已成为水稻遗传转化的主流方法。
水稻转基因技术经过 20 多年发展己建立起农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体转化法和花粉管通道法等 10 多种遗传转化技术体系，并在提高水稻品质、产量和增加抗逆性等方面取得了很大的成就[10,1112]。目前，国内外学者普遍重视水稻农杆菌介导转化技术，农杆菌介导的水稻遗传转化方法已达到了应用的阶段并成为水稻转化的主流技术，这一方法将进一步朝着安全、高效、规模化方向发展。水稻转基因的主要方法是农杆菌介导法和基因枪转化法，这两种方法都是是以愈伤组织为转基因受体，通过农杆浸染，依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养的植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。这两种方法不仅受植物种类、基因型、外植体再生能力、农杆菌的活力等诸多因素的影响，而且存在着遗传转化成本高，工作量大、周期长，转基因植株的育性降低甚至丧失等缺点，因此需要进一步改进。非组织培养方法的转基因技术的探索与成功必将带来转基因育种新的飞跃[6]。
本研究旨在建立一种不依赖于组织培养、可以稳定、高效、适合于规模化操作的农杆菌转化水稻的新方法
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
本研究选用供试材料为籼稻9311，种植于大学江浦实验站，
1.1.2 菌株、生化试剂
有目的载体的农杆菌菌株EHA105为本实验室保存。PCR反应所用rTaq、dNTP、T4DNA连接酶购于Takara公司。卡那霉素、培养基配制所需化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 PCR引物
本实验所用PCR引物（如表1）由南京金斯瑞公司合成。
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