pentrdtopo载体改造及其应用
摘要：本试验目的为探寻一种快速的、便捷的、低成本的且与Gateway系统功能兼容的载体，且将其应用于验证水稻蛋白间的互作。将pUC19的多酶切位点插入载体pENTR/D-TOPO载体中，成功获得改造载体pENTR_MCS。进而将已经克隆的水稻基因OsAGO18、OsPRMT通过酶切、连接等过程连接到改造载体上。利用Gateway系统中的LR反应，将OsAGO18、OsPRMT基因分别连接到表达载体pEG202、pEG201上。电转农杆菌后注射本氏烟，并通过免疫共沉淀（CO-IP）验证OsAGO18和OsPRMT是否存在互作关系。pENTR_MCS质粒的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，也为验证其功能和蛋白互作方面的研究奠定了基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与仪器 2
1.1实验材料 2
1.1.1 植物 2
1.1.2引物 3
1.1.3质粒和菌株 3
1.1.4 试剂 3
1.1.5培养基 3
1.2主要仪器 3
2.实验方法 3
2.1 pENTR/DTOPO载体的改造 3
2.1.1 pUC19多克隆位点基因的克隆 3
2.1.2 DNA的回收 4
2.1.3 pUC19MCS和pENTR/DTOPO载体连接 4
2.1.4大肠杆菌JM109超级感受态细胞的制备 4
2.1.5热激转化大肠杆菌 4
2.1.6菌落PCR鉴定 5
2.1.7 质粒提取 5
2.1.8质粒测序 5
2.2 pENTR_MCS: OsAGO18载体的构建 5
2.2.1 OsAGO18的克隆 5
2.2.2 酶切与pENTR_MCS载体连接 6
2.3 pENTR_MCS:OsPRMT载体的构建 6
2.3.1 OsPRMT的克隆 6
2.3.2 酶切与pENTR_MCS载体连接 7
/> 2.4 表达载体的构建 7
2.4.1酶切 7
2.4.2 LR反应 8
2.4.3 菌落PCR验证 8
2.4.4电转 8
2.5蛋白表达 8
2.5.1侵染烟草 8
2.5.2检测总蛋白 8
2.6 COIP验证 9
2.6.1 SDSPAGE 9
2.6.2转膜 9
2.6.3免疫反应 9
3．结果与分析 9
3.1pUC19_MCS克隆结果与分析 9
3.2 pENTR_MCS:OsAGO18的构建结果与验证 10
3.3pENTR_MCS:OsPRMT的的构建结果与验证 11
3.4 表达载体pEG202:OsAGO18和 pEG201:OsPRMT的构建结果与分析 12
3.5 pEG202:OsAGO18与pEG201:OsPRMT免疫反应的结果与分析 13
4．讨论 13
致谢 14
参考文献 14
pENTR/DTOPO载体改造及其应用
引言
载体pENTR/DTOPO是Gateway系统的入门载体，同时也是TOPO克隆载体中的一种[14]。其具有可在真核细胞内表达，连接效率高的优点。载体pENTR/DTOPO已经被广泛应用于人类医学等方面的研究，并有多种被成功改造的案例[57]。但其缺点在于成本高，且无多克隆位点。载体pUC19是一种分子量较小，结构紧凑的载体。由于其分子量小，遗传学图谱上具有ampr、polylinker及lacz等位点，且具有比其他质粒载体更完善、有效的优越性。所以载体pUC19应用非常广泛，尤其在DNA片段的克隆、DNA测序、对外源基因进行表达等方面[811]。载体pUC19表达lacz基因产物(β半乳糖苷酶)的氨基酸片段在相应宿主中可出现α互补，因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。同时载体pUC19遗传基图谱上具有ampr，选择克隆菌落还可用氨苄青霉素抗性平板作为选择培养基筛选重组质粒。
图1 pUC19载体结构图
Figure1 the pUC19 vector chart
图2 pENTR/DTOPO载体结构图
Figure2 the pENTR/DTOPO vector chart
本试验通过在克隆载体pENTR/DTOPO上插入载体pUC19的多酶切位点，从而对pENTR/DTOPO载体进行改造，得到了pENTR_MCS载体。利用Gateway系统通过LR反应，将OsAGO18、OsPRMT基因分别连接到表达载体pEG202、pEG201上，即构建了pEG202:OsAGO18载体与pEG201:OsPRMT载体转入农杆菌后注射烟草，并利用COIP的技术验证OsAGO18和OsPRMT是否存在互作关系。
1 材料与仪器
1．1 实验材料
1.1.1植物
本氏烟草
1.1.2引物
下划线处为酶切位点。
克隆pUC19多克隆位点基因的特异引物:
pENTR/D_MCSF
CAC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC
pENTR/D_MCSR
ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG C
克隆OsAGO18基因的特异引物：
OsAGO18pENTR_MCSF
CCGGAATTC ATGGCGAGCCGAGG
OsAGO18pENTR_MCSRstop
CTAGTCTAGACTAGCAAAAGAACATG
克隆OsPRMT基因的特异引物：
OsPRMTpENTR_MCSF
CCGGAATTCATGGATCAGCGCAAGGGC
OsPRMTpENTR_MCSRstop
TGCTCTAGATCACCGCATCTTGTAGTGTTGTGTTC
1.1.3质粒和菌株
克隆载体pUC19；克隆载体pENTR；植物表达载体pEG202；植物表达载体pEG201；载体pENTR_MCS；载体pENTR_MCS:OsAGO18；载体pENTR_MCS:OsPRMT；大肠杆菌JM109；农杆菌GV3101。
1.1.4试剂
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与仪器 2
1.1实验材料 2
1.1.1 植物 2
1.1.2引物 3
1.1.3质粒和菌株 3
1.1.4 试剂 3
1.1.5培养基 3
1.2主要仪器 3
2.实验方法 3
2.1 pENTR/DTOPO载体的改造 3
2.1.1 pUC19多克隆位点基因的克隆 3
2.1.2 DNA的回收 4
2.1.3 pUC19MCS和pENTR/DTOPO载体连接 4
2.1.4大肠杆菌JM109超级感受态细胞的制备 4
2.1.5热激转化大肠杆菌 4
2.1.6菌落PCR鉴定 5
2.1.7 质粒提取 5
2.1.8质粒测序 5
2.2 pENTR_MCS: OsAGO18载体的构建 5
2.2.1 OsAGO18的克隆 5
2.2.2 酶切与pENTR_MCS载体连接 6
2.3 pENTR_MCS:OsPRMT载体的构建 6
2.3.1 OsPRMT的克隆 6
2.3.2 酶切与pENTR_MCS载体连接 7
/> 2.4 表达载体的构建 7
2.4.1酶切 7
2.4.2 LR反应 8
2.4.3 菌落PCR验证 8
2.4.4电转 8
2.5蛋白表达 8
2.5.1侵染烟草 8
2.5.2检测总蛋白 8
2.6 COIP验证 9
2.6.1 SDSPAGE 9
2.6.2转膜 9
2.6.3免疫反应 9
3．结果与分析 9
3.1pUC19_MCS克隆结果与分析 9
3.2 pENTR_MCS:OsAGO18的构建结果与验证 10
3.3pENTR_MCS:OsPRMT的的构建结果与验证 11
3.4 表达载体pEG202:OsAGO18和 pEG201:OsPRMT的构建结果与分析 12
3.5 pEG202:OsAGO18与pEG201:OsPRMT免疫反应的结果与分析 13
4．讨论 13
致谢 14
参考文献 14
pENTR/DTOPO载体改造及其应用
引言
载体pENTR/DTOPO是Gateway系统的入门载体，同时也是TOPO克隆载体中的一种[14]。其具有可在真核细胞内表达，连接效率高的优点。载体pENTR/DTOPO已经被广泛应用于人类医学等方面的研究，并有多种被成功改造的案例[57]。但其缺点在于成本高，且无多克隆位点。载体pUC19是一种分子量较小，结构紧凑的载体。由于其分子量小，遗传学图谱上具有ampr、polylinker及lacz等位点，且具有比其他质粒载体更完善、有效的优越性。所以载体pUC19应用非常广泛，尤其在DNA片段的克隆、DNA测序、对外源基因进行表达等方面[811]。载体pUC19表达lacz基因产物(β半乳糖苷酶)的氨基酸片段在相应宿主中可出现α互补，因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。同时载体pUC19遗传基图谱上具有ampr，选择克隆菌落还可用氨苄青霉素抗性平板作为选择培养基筛选重组质粒。
图1 pUC19载体结构图
Figure1 the pUC19 vector chart
图2 pENTR/DTOPO载体结构图
Figure2 the pENTR/DTOPO vector chart
本试验通过在克隆载体pENTR/DTOPO上插入载体pUC19的多酶切位点，从而对pENTR/DTOPO载体进行改造，得到了pENTR_MCS载体。利用Gateway系统通过LR反应，将OsAGO18、OsPRMT基因分别连接到表达载体pEG202、pEG201上，即构建了pEG202:OsAGO18载体与pEG201:OsPRMT载体转入农杆菌后注射烟草，并利用COIP的技术验证OsAGO18和OsPRMT是否存在互作关系。
1 材料与仪器
1．1 实验材料
1.1.1植物
本氏烟草
1.1.2引物
下划线处为酶切位点。
克隆pUC19多克隆位点基因的特异引物:
pENTR/D_MCSF
CAC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC
pENTR/D_MCSR
ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG C
克隆OsAGO18基因的特异引物：
OsAGO18pENTR_MCSF
CCGGAATTC ATGGCGAGCCGAGG
OsAGO18pENTR_MCSRstop
CTAGTCTAGACTAGCAAAAGAACATG
克隆OsPRMT基因的特异引物：
OsPRMTpENTR_MCSF
CCGGAATTCATGGATCAGCGCAAGGGC
OsPRMTpENTR_MCSRstop
TGCTCTAGATCACCGCATCTTGTAGTGTTGTGTTC
1.1.3质粒和菌株
克隆载体pUC19；克隆载体pENTR；植物表达载体pEG202；植物表达载体pEG201；载体pENTR_MCS；载体pENTR_MCS:OsAGO18；载体pENTR_MCS:OsPRMT；大肠杆菌JM109；农杆菌GV3101。
1.1.4试剂
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