芽孢杆菌菌株鉴定及抑菌物质分析
摘要：作为根围促生细菌的芽孢杆菌具有抗病作用，被开发成生物农药应用于农业生产。本研究以实验室分离的具有较好的抑菌活性芽孢杆菌M4H4和M4H8 这2个菌株为研究对象，研究其抗菌机理。采用16s rDNA和gyrB基因序列比对法对上述菌株进行分析鉴定，并对芽孢杆菌产生的抗菌物质进行MALDI-TOF分析和分离纯化，研究抗菌物质的抑菌功能，为将菌株开发成生物农药提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 菌株鉴定2
1.1.1菌株与指示菌2
1.1.2培养基2
1.1.3分子生物学试剂2
1.2 菌株培养2
1.3 菌株的保存2
1.4 基因鉴定 2
1.4.1 16s rDNA基因鉴定2
1.4.1.1引物合成2
1.4.1.2 16s rDNA扩增2
1.4.2 gyrB基因序列 3
1.4.2.1引物合成3
1.4.2.2 gyrB基因的PCR扩增3
1.5 DNA片断的回收3
1.6 16s rDNA TA克隆 4
1.6.1连接4
1.6.2 制备感受态4
1.6.3转化4
1.7 提取质粒4
1.8 测序4
1.8.1 16S rDNA序列鉴定4
1.8.1.1 引物合成4
1.8.1.2 16S rDNA的PCR扩增4
1.8.1.3 16S rDNA序列分析5
1.8.2 gyrB基因序列鉴定5
1.8.2.1 引物合成5
1.8.2.2 gyrB基因的PCR扩增5
1.8.2.3 gyrB基因序列分析5
1.9 抗菌机理5
1.9.1 菌培养5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.9.1.1 病原真菌培养5
1.9.1.2 病原细菌培养6
1.9.1.3 芽抱杆菌培养6
1.10 生防芽孢杆菌筛选 6
1.10.1 拮抗水稻白叶枯病菌活性测定6
1.10.2 拮抗油菜菌核病原真菌活性测定6
1.11 质谱分析6
1.11.1 脂肽类化合物粗提6
1.11.2 MALDITOFMS分析6
1.12 脂肽类化合物活性检测 6
2 结果与分析6
2.1 菌株的鉴定结果6
2.1. 1 16S rDNA序列鉴定6
2.1.2 gyrB基因序列鉴定7
2.1.3 基因测序结果7
2.2 芽孢杆菌抗菌作用7
2.2.1 芽孢杆菌对水稻白叶枯和油菜菌核病菌的抑制作用7
2.2.2 芽孢杆菌抗菌物质的MALDITOFMS质谱测定7
2.2.3 脂肽化合物抑病原菌活性8
3讨论
9
致谢9
参考文献10
附录11
芽孢杆菌菌株鉴定及抑菌物质分析
引言
长期以来化学农药一直是植物病害防治的主要方式，它对农业生产上防治病虫害起到了十分重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。因此开发对人类和环境友好、并具良好防治效果的新的植物病虫害防治策略尤为重要[1]。
在植物病害生物防治的探索过程中，科研工作者利用不同的有益微生物，在植物病害防治上做了大量的研究工作。目前，用于植物病害生物防治的细菌的种类繁多,生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等;细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌(PGPR)、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种；病毒的弱毒株系；病原菌的无致病力突变菌株[2]。
其中的芽孢杆菌是目前研究较为广泛的且有着许多防效的细菌。而且芽孢杆菌能够对许多植物产生生长、竞争、拮抗和诱导植物抗性的作用[3]，这引起了人们对其促生防病机理研究的兴趣，目前已有许多文献对这方面的研究进行了报道。关于芽孢杆菌的防病促生作用机制，国内外学者进行了大量研究。普遍认为芽孢杆菌生防机制主要有营养和空间位点竞争、抗菌物质产生[4]、溶菌作用、诱导植物抗病性等方面[5]。其生防效果是以上几种方式作用的综合结果。
芽孢杆菌属细菌表型特征多样，传统的基于表型特征和生理生化反应的芽孢杆菌鉴定方法准确性较低，存在很多不确定因素。16s rDNA 分析鉴定方法的出现，给细菌包括芽孢杆菌的鉴定带来新方法。近年来，一些较保守的蛋白编码基因gyrB序列和gyrA序列的基因序列分析也被广泛应用于芽孢杆菌属细菌的分类鉴定中[6]。利用表型特征，生理生化测定，分子鉴定等方法相结合的鉴定手段，可以更为准确地将芽孢杆菌鉴定到种。
根据本课题组之前对芽孢杆菌的抑菌活性物质的研究结果表明，芽孢杆菌的主要生物活性物质源于芽孢杆菌能够通过非核糖体肽途径合成脂肽类化合物[7]、聚酮类化合物[8]和一些小分子多肽类物质等活性物质，脂肽化合物和聚酮化合物表现出抑真菌、细菌、病毒、菌原体和抗肿瘤等广泛的生物活性，同时也参与细菌重要功能结构单位生物膜（biofilm）的形成，是芽孢杆菌在土壤中生存和与其它微生物竞争的重要武器。本研究以实验室分离的具有较好的抑菌活性芽孢杆菌M4H4和M4H8 这2个菌株为研究对象，对其进行鉴定。并对其产生的生物活性物质进行分析。同时，以水稻白叶枯病原细菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）及油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）作为病原指示菌，研究其抑菌功能。
1 材料与方法
1．1 菌株鉴定
1．1．1 菌株与指示菌
芽孢杆菌M4H4和M4H8 这2个菌株为实验室保存。
病原指示菌：油菜菌核病原真菌（Sclerotinia sclerotiorum）由本实验室保存,水稻白叶枯病原细菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）由大学杀菌剂实验室提供。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 菌株鉴定2
1.1.1菌株与指示菌2
1.1.2培养基2
1.1.3分子生物学试剂2
1.2 菌株培养2
1.3 菌株的保存2
1.4 基因鉴定 2
1.4.1 16s rDNA基因鉴定2
1.4.1.1引物合成2
1.4.1.2 16s rDNA扩增2
1.4.2 gyrB基因序列 3
1.4.2.1引物合成3
1.4.2.2 gyrB基因的PCR扩增3
1.5 DNA片断的回收3
1.6 16s rDNA TA克隆 4
1.6.1连接4
1.6.2 制备感受态4
1.6.3转化4
1.7 提取质粒4
1.8 测序4
1.8.1 16S rDNA序列鉴定4
1.8.1.1 引物合成4
1.8.1.2 16S rDNA的PCR扩增4
1.8.1.3 16S rDNA序列分析5
1.8.2 gyrB基因序列鉴定5
1.8.2.1 引物合成5
1.8.2.2 gyrB基因的PCR扩增5
1.8.2.3 gyrB基因序列分析5
1.9 抗菌机理5
1.9.1 菌培养5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.9.1.1 病原真菌培养5
1.9.1.2 病原细菌培养6
1.9.1.3 芽抱杆菌培养6
1.10 生防芽孢杆菌筛选 6
1.10.1 拮抗水稻白叶枯病菌活性测定6
1.10.2 拮抗油菜菌核病原真菌活性测定6
1.11 质谱分析6
1.11.1 脂肽类化合物粗提6
1.11.2 MALDITOFMS分析6
1.12 脂肽类化合物活性检测 6
2 结果与分析6
2.1 菌株的鉴定结果6
2.1. 1 16S rDNA序列鉴定6
2.1.2 gyrB基因序列鉴定7
2.1.3 基因测序结果7
2.2 芽孢杆菌抗菌作用7
2.2.1 芽孢杆菌对水稻白叶枯和油菜菌核病菌的抑制作用7
2.2.2 芽孢杆菌抗菌物质的MALDITOFMS质谱测定7
2.2.3 脂肽化合物抑病原菌活性8
3讨论
9
致谢9
参考文献10
附录11
芽孢杆菌菌株鉴定及抑菌物质分析
引言
长期以来化学农药一直是植物病害防治的主要方式，它对农业生产上防治病虫害起到了十分重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。因此开发对人类和环境友好、并具良好防治效果的新的植物病虫害防治策略尤为重要[1]。
在植物病害生物防治的探索过程中，科研工作者利用不同的有益微生物，在植物病害防治上做了大量的研究工作。目前，用于植物病害生物防治的细菌的种类繁多,生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等;细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌(PGPR)、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种；病毒的弱毒株系；病原菌的无致病力突变菌株[2]。
其中的芽孢杆菌是目前研究较为广泛的且有着许多防效的细菌。而且芽孢杆菌能够对许多植物产生生长、竞争、拮抗和诱导植物抗性的作用[3]，这引起了人们对其促生防病机理研究的兴趣，目前已有许多文献对这方面的研究进行了报道。关于芽孢杆菌的防病促生作用机制，国内外学者进行了大量研究。普遍认为芽孢杆菌生防机制主要有营养和空间位点竞争、抗菌物质产生[4]、溶菌作用、诱导植物抗病性等方面[5]。其生防效果是以上几种方式作用的综合结果。
芽孢杆菌属细菌表型特征多样，传统的基于表型特征和生理生化反应的芽孢杆菌鉴定方法准确性较低，存在很多不确定因素。16s rDNA 分析鉴定方法的出现，给细菌包括芽孢杆菌的鉴定带来新方法。近年来，一些较保守的蛋白编码基因gyrB序列和gyrA序列的基因序列分析也被广泛应用于芽孢杆菌属细菌的分类鉴定中[6]。利用表型特征，生理生化测定，分子鉴定等方法相结合的鉴定手段，可以更为准确地将芽孢杆菌鉴定到种。
根据本课题组之前对芽孢杆菌的抑菌活性物质的研究结果表明，芽孢杆菌的主要生物活性物质源于芽孢杆菌能够通过非核糖体肽途径合成脂肽类化合物[7]、聚酮类化合物[8]和一些小分子多肽类物质等活性物质，脂肽化合物和聚酮化合物表现出抑真菌、细菌、病毒、菌原体和抗肿瘤等广泛的生物活性，同时也参与细菌重要功能结构单位生物膜（biofilm）的形成，是芽孢杆菌在土壤中生存和与其它微生物竞争的重要武器。本研究以实验室分离的具有较好的抑菌活性芽孢杆菌M4H4和M4H8 这2个菌株为研究对象，对其进行鉴定。并对其产生的生物活性物质进行分析。同时，以水稻白叶枯病原细菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）及油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）作为病原指示菌，研究其抑菌功能。
1 材料与方法
1．1 菌株鉴定
1．1．1 菌株与指示菌
芽孢杆菌M4H4和M4H8 这2个菌株为实验室保存。
病原指示菌：油菜菌核病原真菌（Sclerotinia sclerotiorum）由本实验室保存,水稻白叶枯病原细菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）由大学杀菌剂实验室提供。
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