禾谷镰孢菌中6个同源fgaat2基因敲除载体的构建及敲除突变体的获得与鉴定
小麦赤霉病其病原菌无性态为禾谷镰孢菌，有性态为玉蜀黍赤霉，是世界范围内小麦最重要病害之一。小麦赤霉病主要发生在中国长江中下游、淮河流域和东部沿海地区，但是近年来病害在中国北部和西部的小麦产区也有加重的趋势。小麦赤霉病不仅会造成产量损失，而且还会因病菌产生影响食品安全的DON毒素。30多年来，我国主要依靠使用化学防治的方法防治小麦赤霉病。在引起麦类赤霉病的禾谷镰孢菌基因组中通过比对鉴定到6个编码天冬氨酸氨基转移酶的同源基因，拟通过基因敲除技术研究这6个AAT2基因的生物学功能。本论文的主要内容包括6个AAT2基因敲除载体的构建，通过PEG介导的原生质体转化获得相应基因的转化子，再对转化子进行验证，获得原位插入的敲除突变体，为下一步生物学功能的分析提供材料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2.1 实验菌株与质粒 2
1.2.2 常用培养基 2
1.2.3 常用试剂3
1.1.4 实验材料与仪器4
1.2 方法 4
1.2.1 小麦赤霉菌种的保存、培养、产孢4
1.2.2 DNA的提取（小抽DNA）4
1.2.3 pBlueScripthph质粒的提取5
1.2.4 禾谷镰刀菌基因敲除技术5
1.2.5 DNA琼脂糖电泳8
1.2.6 PCR产物提纯8
1.2.7 小麦赤霉病菌的遗传转化8
2 结果与分析9
2.1 禾谷镰刀菌FgAAT2基因敲除载体的构建9
2.1.1 引物设计 9
2.1.2 构建基因敲除片段10
2.2 敲除突变体的获得与鉴定12
2.2.1 PCR鉴定 12
3 讨论 15
致谢15
参考文献16
禾谷镰孢菌中6个同源FgAAT2基因敲除载体的构建及敲除突变体的获得与鉴定
引言
禾谷镰刀复合种 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
（Fusarium graminearumum complex）引起的赤霉病是小麦的重要病害之一[1]，主要发生在长江中下游麦区和东北春麦区，近年来由于秸秆还田等耕作方式的改变和全球变暖等气候因素的影响，赤霉病还有蔓延到黄淮麦区的趋势。在我国，赤霉病年发生7000万亩以上，占全国小麦种植面积的16%；2010年和2012年赤霉病大发生，发病面积均超过1亿亩，给农业生产造成了巨大的经济损失。赤霉病除了造成减产外，感病籽粒中含有的多种真菌毒素如脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）和玉蜀黍赤霉烯酮（ZEN），危害人畜健康，对食品安全构成严重威胁[2]。目前生产上由于缺乏抗赤霉病的小麦品种，化学防治仍是控制小麦赤霉病流行的最有效途径，但是目前对镰刀菌有效的药剂品种很少，我国自上个世纪70年代以来长期使用苯并咪唑类杀菌剂（如多菌灵）防治小麦赤霉病。由于长期单一使用，多菌灵的抗药性问题严峻[3,4]，在长江中下游麦区多菌灵的防效已显著下降。深入研究禾谷镰刀菌的生物学以及产毒致病机制对于赤霉病和赤霉毒素的持续防控具有重要的理论指导意义。
天冬氨酸转氨酶是转氨反应的高效催化剂，并且对细胞中氮和碳的代谢起到非常重要的作用。在模式真菌酿酒酵母中，天冬氨酸转氨酶仅由一个基因AAT2编码，在S288C菌株背景中AAT2缺失不致死，但在Sigma1278b菌株背景中AAT2是必需基因，缺失致死。S288C中AAT2基因缺失引起一系列表型缺陷[5，6]，包括生长速率下降，在富营养培养基上适合度下降，对温度敏感，且表现出对多种DNA合成抑制剂和高渗透胁迫更加敏感，表明在酿酒酵母中AAT2基因在菌体生长发育和适应外源环境过程中具有重要作用。
本论文在引起麦类赤霉病的禾谷镰孢菌基因组中通过比对鉴定到6个编码天冬氨酸氨基转移酶的同源基因，拟通过基因敲除技术研究这6个AAT2基因的生物学功能。本论文的主要内容包括6个AAT2基因敲除载体的构建，通过PEG介导的原生质体转化获得相应基因的转化子，再对转化子进行验证，获得原位插入的敲除突变体，为下一步生物学功能的分析提供材料。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验菌株与质粒
①禾谷镰刀菌野生型菌株PH1和GZ3639，菌株放于25℃培养箱培养。
②质粒pBlueScriptHPH
1．1．2 常用培养基
①PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基：
土豆
200g
葡萄糖
20g
琼脂条
20g
加dd H2O定容至1000ml，于121℃高压灭菌20分钟。
②YEPD（酵母粉蛋白胨葡萄糖琼脂）培养基：
蛋白胨
10 g
酵母粉
3 g
葡萄糖
20 g
用1 mol/L NaOH溶液 将pH值调至7.5，加dd H2O定容至1000ml，121℃高压灭菌20 分钟。
③绿豆汤产孢培养基：
绿豆
15 g
水煮40分钟后用三层纱布过滤，加dd H2O定容至1000 ml，于121℃灭菌20分钟。
④LB 培养基：
胰蛋白胨
10g
酵母粉
5 g
NaCl
10 g
用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5，加dd H2O 定容至1000 ml，于121℃高压灭菌20 分钟。
⑤RM培养基：
水解溶蛋白（Casein hydrolysate）
1 g
酵母粉
1 g
蔗糖
274 g
用1 mol/LNaOH 溶液将pH值调至7.5，加dd H2O定容至1000 ml，121℃高压灭菌20 分钟。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2.1 实验菌株与质粒 2
1.2.2 常用培养基 2
1.2.3 常用试剂3
1.1.4 实验材料与仪器4
1.2 方法 4
1.2.1 小麦赤霉菌种的保存、培养、产孢4
1.2.2 DNA的提取（小抽DNA）4
1.2.3 pBlueScripthph质粒的提取5
1.2.4 禾谷镰刀菌基因敲除技术5
1.2.5 DNA琼脂糖电泳8
1.2.6 PCR产物提纯8
1.2.7 小麦赤霉病菌的遗传转化8
2 结果与分析9
2.1 禾谷镰刀菌FgAAT2基因敲除载体的构建9
2.1.1 引物设计 9
2.1.2 构建基因敲除片段10
2.2 敲除突变体的获得与鉴定12
2.2.1 PCR鉴定 12
3 讨论 15
致谢15
参考文献16
禾谷镰孢菌中6个同源FgAAT2基因敲除载体的构建及敲除突变体的获得与鉴定
引言
禾谷镰刀复合种 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
（Fusarium graminearumum complex）引起的赤霉病是小麦的重要病害之一[1]，主要发生在长江中下游麦区和东北春麦区，近年来由于秸秆还田等耕作方式的改变和全球变暖等气候因素的影响，赤霉病还有蔓延到黄淮麦区的趋势。在我国，赤霉病年发生7000万亩以上，占全国小麦种植面积的16%；2010年和2012年赤霉病大发生，发病面积均超过1亿亩，给农业生产造成了巨大的经济损失。赤霉病除了造成减产外，感病籽粒中含有的多种真菌毒素如脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）和玉蜀黍赤霉烯酮（ZEN），危害人畜健康，对食品安全构成严重威胁[2]。目前生产上由于缺乏抗赤霉病的小麦品种，化学防治仍是控制小麦赤霉病流行的最有效途径，但是目前对镰刀菌有效的药剂品种很少，我国自上个世纪70年代以来长期使用苯并咪唑类杀菌剂（如多菌灵）防治小麦赤霉病。由于长期单一使用，多菌灵的抗药性问题严峻[3,4]，在长江中下游麦区多菌灵的防效已显著下降。深入研究禾谷镰刀菌的生物学以及产毒致病机制对于赤霉病和赤霉毒素的持续防控具有重要的理论指导意义。
天冬氨酸转氨酶是转氨反应的高效催化剂，并且对细胞中氮和碳的代谢起到非常重要的作用。在模式真菌酿酒酵母中，天冬氨酸转氨酶仅由一个基因AAT2编码，在S288C菌株背景中AAT2缺失不致死，但在Sigma1278b菌株背景中AAT2是必需基因，缺失致死。S288C中AAT2基因缺失引起一系列表型缺陷[5，6]，包括生长速率下降，在富营养培养基上适合度下降，对温度敏感，且表现出对多种DNA合成抑制剂和高渗透胁迫更加敏感，表明在酿酒酵母中AAT2基因在菌体生长发育和适应外源环境过程中具有重要作用。
本论文在引起麦类赤霉病的禾谷镰孢菌基因组中通过比对鉴定到6个编码天冬氨酸氨基转移酶的同源基因，拟通过基因敲除技术研究这6个AAT2基因的生物学功能。本论文的主要内容包括6个AAT2基因敲除载体的构建，通过PEG介导的原生质体转化获得相应基因的转化子，再对转化子进行验证，获得原位插入的敲除突变体，为下一步生物学功能的分析提供材料。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验菌株与质粒
①禾谷镰刀菌野生型菌株PH1和GZ3639，菌株放于25℃培养箱培养。
②质粒pBlueScriptHPH
1．1．2 常用培养基
①PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基：
土豆
200g
葡萄糖
20g
琼脂条
20g
加dd H2O定容至1000ml，于121℃高压灭菌20分钟。
②YEPD（酵母粉蛋白胨葡萄糖琼脂）培养基：
蛋白胨
10 g
酵母粉
3 g
葡萄糖
20 g
用1 mol/L NaOH溶液 将pH值调至7.5，加dd H2O定容至1000ml，121℃高压灭菌20 分钟。
③绿豆汤产孢培养基：
绿豆
15 g
水煮40分钟后用三层纱布过滤，加dd H2O定容至1000 ml，于121℃灭菌20分钟。
④LB 培养基：
胰蛋白胨
10g
酵母粉
5 g
NaCl
10 g
用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5，加dd H2O 定容至1000 ml，于121℃高压灭菌20 分钟。
⑤RM培养基：
水解溶蛋白（Casein hydrolysate）
1 g
酵母粉
1 g
蔗糖
274 g
用1 mol/LNaOH 溶液将pH值调至7.5，加dd H2O定容至1000 ml，121℃高压灭菌20 分钟。
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