黄瓜内生细菌的鉴定及生防特性初探
本研究以一种黄瓜上分离出的内生细菌为研究对象，通过培养性状观察及16S rDNA同源性序列分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。采用平板对峙法，进行了茄镰刀病菌、洋葱镰刀病菌、香蕉镰刀病菌、辣椒疫霉病菌的抑菌实验，发现该内生菌对这4种病原均具有良好的抑菌性，对镰刀菌的抑菌性更加明显。利用10×、100×该细菌发酵上清液和CK处理番茄、辣椒、空心菜和豇豆的种子，15天后测定种子的芽长和根长，以探究该内生细菌对作物生长发育的影响,结果显示100×发酵上清液对种子发芽有明显的促生作用。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌种3
1.1.2植物材料3
1.1.3培养基3
1.1.4主要仪器3
1.2方法 3
1.2.1黄瓜内生细菌的鉴定3
1.2.1.1培养性状3
1.2.1.2分子鉴定4
1.2.2黄瓜内生细菌的抑菌谱测定4
1.2.3黄瓜内生细菌的促生作用实验4
2结果与分析4
2.1黄瓜内生细菌的鉴定4
2.1.1培养性状5
2.1.2分子鉴定16S rDNA序列分析5
2.2黄瓜内生细菌对指示真菌的抑菌谱测定6
2.3黄瓜内生细菌的促生作用实验7
3结论 8
致谢9
参考文献9
黄瓜内生细菌的鉴定及生防特性初探
引言
植物内生菌(endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，既可以产生各种化学物质，又可以通过竞争或其他作用来抑制杀死各种致病菌，因此在农业生产中作为一种生物农药具有广泛应用前景。其中，内生细菌是植物体自然生态系统成员，是微生态系统的天然组成成分，作为生防微生物效果显著[13]。
本实验室从海南省定安县采到的健康黄瓜上分离出一株内生细菌，通过生理生化特征和16S rDNA 序列分析，对该菌株进行 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
鉴定。为了进一步探明该内生细菌的生防特性，对其产生的抗真菌物质的特性进行了初步研究，了解该内生菌对作物的生长影响，以及对几类重要植物病原真菌的拮抗作用，以期在生产实践中利用该内生细菌进行生物防治提供依据[45]。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种
拮抗细菌由健康黄瓜叶片分离所得，黄化样品采集自海南省定安县。指示菌为茄类镰刀菌（Fusarium solani）、洋葱镰刀病菌、香蕉镰刀病菌、辣椒疫霉病菌，均为本实验室保存。
1．1．2 植物材料
满天红番茄2304种子（由广州亚蔬园艺种苗有限公司提供）、丽皇黄皮辣椒种子（由广东金作农业科技有限公司提供）、华赣豇豆种子（由江西华农种业有限公司提供）、空心菜种子（由沭阳县永发苗木园艺场提供）。
1．1．3 培养基
LB培养基：酵母提取物5g，NaCl 10g，蛋白胨10g，琼脂20g，pH调至7.0，加水至1L。
NA培养基：酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，葡萄糖15g，蛋白胨5g，琼脂20g，pH调至7.0，加水至1L。
PDA培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂20g，加水至1L。
1．1．4 主要仪器
JY600C通用型电泳仪、德国Eppendorf 5418 小型高速离心机、Tanon4200紫外凝胶成像系统、GXZ250B智能光照培养箱250L、上海苏坤SKY200B全温型小容量恒温培养摇床。
1．2 方法
1．2．1 黄瓜内生细菌的鉴定
1．2．1．1 培养性状
利用平板划线法，将待测黄瓜内生细菌接种在LB固体培养基上，27℃恒温培养48h，观察其菌落形态。
1．2．1．2 分子鉴定
参照Hu H.Q.等人的方法提取待测黄瓜内生细菌的基因组总DNA[6]，采用细菌通用引物27f 和1492r 扩增了其16S rDNA 序列，引物序列分别为：27f:5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3；1492r:5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3。PCR反应体系：PCR?Master?Mix 10μL，引物(10 μmol/L)各1μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 7μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，送广州英骏公司测序，将测序结果的序列与GenBank 中已知的相关种属的菌株的16S rDNA 进行同源性比较[7]。
1．2．2 黄瓜内生细菌的抑菌谱测定
菌株代谢液的制备：挑取单菌落，转移到装有 10 mL LB 培养液的试管（体积为
20 mL）中，37 ℃、120r/min 恒温振荡培养 12 h[8]。培养好的菌液以12000 r/min离心5min，取上清液，用双层滤纸过滤，收集到的滤液即为菌株的代谢粗提产物[9]。
黄瓜内生细菌代谢液对指示真菌的抑菌谱测定：采用平板对峙培养法，制作PDA
平板，沿培养好的指示菌菌落边缘用打孔器取直径5mm的菌碟，放入平板中央，四周距菌落2.5cm处呈等边三角形状打3个孔，点置注入20μL细菌代谢物粗提液[10]。每种指示菌设3个重复，25 ℃下培养，3d后检查并测量抑菌圈直径，计算平均值。
1．2．3 黄瓜内生细菌的促生作用实验
取子粒饱满、整齐一致的植物种子，播入铺有滤纸的无菌培养皿内，豇豆10颗/皿、番茄25颗/皿、辣椒20颗/皿、空心菜20颗/皿，每种蔬菜共放12个皿。
参照1. 2. 2的方法制备菌体代谢粗提液，采用梯度稀释法，设置3个处理、1个无菌水对照，3个处理分别是原液、10倍稀释液、100倍稀释液，加入到含种子的培养皿中。每种蔬菜3个处理，每处理3个重复。置于25℃恒温培养箱内培养，及时补充水分，保持皿内湿度。10天后测定发芽率，同时测定种子发芽的芽长、根长。芽长、根长为每个处理中所有发芽种子的平均值。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌种3
1.1.2植物材料3
1.1.3培养基3
1.1.4主要仪器3
1.2方法 3
1.2.1黄瓜内生细菌的鉴定3
1.2.1.1培养性状3
1.2.1.2分子鉴定4
1.2.2黄瓜内生细菌的抑菌谱测定4
1.2.3黄瓜内生细菌的促生作用实验4
2结果与分析4
2.1黄瓜内生细菌的鉴定4
2.1.1培养性状5
2.1.2分子鉴定16S rDNA序列分析5
2.2黄瓜内生细菌对指示真菌的抑菌谱测定6
2.3黄瓜内生细菌的促生作用实验7
3结论 8
致谢9
参考文献9
黄瓜内生细菌的鉴定及生防特性初探
引言
植物内生菌(endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，既可以产生各种化学物质，又可以通过竞争或其他作用来抑制杀死各种致病菌，因此在农业生产中作为一种生物农药具有广泛应用前景。其中，内生细菌是植物体自然生态系统成员，是微生态系统的天然组成成分，作为生防微生物效果显著[13]。
本实验室从海南省定安县采到的健康黄瓜上分离出一株内生细菌，通过生理生化特征和16S rDNA 序列分析，对该菌株进行 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
鉴定。为了进一步探明该内生细菌的生防特性，对其产生的抗真菌物质的特性进行了初步研究，了解该内生菌对作物的生长影响，以及对几类重要植物病原真菌的拮抗作用，以期在生产实践中利用该内生细菌进行生物防治提供依据[45]。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种
拮抗细菌由健康黄瓜叶片分离所得，黄化样品采集自海南省定安县。指示菌为茄类镰刀菌（Fusarium solani）、洋葱镰刀病菌、香蕉镰刀病菌、辣椒疫霉病菌，均为本实验室保存。
1．1．2 植物材料
满天红番茄2304种子（由广州亚蔬园艺种苗有限公司提供）、丽皇黄皮辣椒种子（由广东金作农业科技有限公司提供）、华赣豇豆种子（由江西华农种业有限公司提供）、空心菜种子（由沭阳县永发苗木园艺场提供）。
1．1．3 培养基
LB培养基：酵母提取物5g，NaCl 10g，蛋白胨10g，琼脂20g，pH调至7.0，加水至1L。
NA培养基：酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，葡萄糖15g，蛋白胨5g，琼脂20g，pH调至7.0，加水至1L。
PDA培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂20g，加水至1L。
1．1．4 主要仪器
JY600C通用型电泳仪、德国Eppendorf 5418 小型高速离心机、Tanon4200紫外凝胶成像系统、GXZ250B智能光照培养箱250L、上海苏坤SKY200B全温型小容量恒温培养摇床。
1．2 方法
1．2．1 黄瓜内生细菌的鉴定
1．2．1．1 培养性状
利用平板划线法，将待测黄瓜内生细菌接种在LB固体培养基上，27℃恒温培养48h，观察其菌落形态。
1．2．1．2 分子鉴定
参照Hu H.Q.等人的方法提取待测黄瓜内生细菌的基因组总DNA[6]，采用细菌通用引物27f 和1492r 扩增了其16S rDNA 序列，引物序列分别为：27f:5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3；1492r:5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3。PCR反应体系：PCR?Master?Mix 10μL，引物(10 μmol/L)各1μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 7μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，送广州英骏公司测序，将测序结果的序列与GenBank 中已知的相关种属的菌株的16S rDNA 进行同源性比较[7]。
1．2．2 黄瓜内生细菌的抑菌谱测定
菌株代谢液的制备：挑取单菌落，转移到装有 10 mL LB 培养液的试管（体积为
20 mL）中，37 ℃、120r/min 恒温振荡培养 12 h[8]。培养好的菌液以12000 r/min离心5min，取上清液，用双层滤纸过滤，收集到的滤液即为菌株的代谢粗提产物[9]。
黄瓜内生细菌代谢液对指示真菌的抑菌谱测定：采用平板对峙培养法，制作PDA
平板，沿培养好的指示菌菌落边缘用打孔器取直径5mm的菌碟，放入平板中央，四周距菌落2.5cm处呈等边三角形状打3个孔，点置注入20μL细菌代谢物粗提液[10]。每种指示菌设3个重复，25 ℃下培养，3d后检查并测量抑菌圈直径，计算平均值。
1．2．3 黄瓜内生细菌的促生作用实验
取子粒饱满、整齐一致的植物种子，播入铺有滤纸的无菌培养皿内，豇豆10颗/皿、番茄25颗/皿、辣椒20颗/皿、空心菜20颗/皿，每种蔬菜共放12个皿。
参照1. 2. 2的方法制备菌体代谢粗提液，采用梯度稀释法，设置3个处理、1个无菌水对照，3个处理分别是原液、10倍稀释液、100倍稀释液，加入到含种子的培养皿中。每种蔬菜3个处理，每处理3个重复。置于25℃恒温培养箱内培养，及时补充水分，保持皿内湿度。10天后测定发芽率，同时测定种子发芽的芽长、根长。芽长、根长为每个处理中所有发芽种子的平均值。
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