拟南芥atmc1基因的克隆及载体构建
small RNAs是一类长度为2l-25个核苷酸单位的非编码RNA分子，它们通过调节mRNA的降解、抑制翻译，控制基因的表达，其与AGO蛋白结合形成RISC，可特异性地沉默靶标基因，从而引起免疫反应。AGO2蛋白在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。目前还不清楚其是如何参与防卫反应的。本实验通过提取拟南芥总RNA，反转录得到cDNA，扩增基因，构建中间载体，为研究AMC1蛋白与AGO2蛋白的互作关系做好前期准备。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1实验材料 2
1.1植物 2
1.2引物2
1.3质粒和菌株 2
1.4试剂2
2实验方法 3
2.1拟南芥总RNA提取 3
2.2RTPCR反转录得到CDNA 4
2.3扩增目的基因 4
2.4中间载体 5
3 分析与讨论 6
致谢 7
参考文献7
拟南芥AtMC1基因的克隆及载体的构建
引言
近年来,德国、英国、美国3个实验室,利用生物信息学、cDNA文库及分子克隆技术,在不同生物体细胞中克隆到包括lin4和let7在内的约150个21～25个核苷酸的非编码小分子RNA[1]。这些RNA具有极强的调控作用,与生物体的阶段性发育密切相关,并意识到这是一个极为广阔的小分子RNA世界[2]。
小RNA是一类新发现的长度为21~25个核苷酸的小分子RNA,它普遍存在于真核生物中,占整个基因组基因总数的2%左右。小RNA是重要的调控RNA分子,它可直接调控某些基因的开关,从而控制细胞的生长发育,并决定细胞分化的组织类型[3]。根据小RNA的生长、结构和功能大约可分为3类：small interfering RNA（siRNA）、microRNA（miRNA)和其他小RNA。小RNA在生物进化过程中高度保守,并已被证实参与和调控包括时序发育、细胞凋亡、神经元发育、激素分泌等在内的多种生理过程[4]。
迄今，在拟南芥基因组中已发现了200多个miRNA基因，在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
水稻中发现的miRNA基因达到400个。研究表明，同编码基因一样，miRNA基因也通过RNA聚合酶II转录，产生miRNA的初级转录产物（primiRNA）。多数primiRNA和编码基因的转录本一样，具有 3＇polyA和 5＇帽子结构，部分primiRNA中还含有内含子[5]。
由小RNA诱导的沉默复合体（RNAinduced silencing complex,RISC）可特异的切割或抑制靶标mRNA的翻译。RNA沉默复合体包括许多部分，如RNA聚合酶、Dicer酶、Argonaute蛋白（AGO）、RNA依赖的RNA聚合酶（RdRPs）等[6]。拟南芥总共编码10种AGO蛋白，其中AGO2在植物抗病免疫中发挥重要作用[7]。为了深入研究AGO2在植物抗病中的作用机制，本实验前期已利用COIP和LCMS/MS鉴定与拟南芥AGO2互作的蛋白，并通过测序和表达谱分析，选取差异表达显著的AMC1蛋白，并进行以下的实验研究。
为了验证拟南芥AGO2蛋白和AMC1蛋白之间的互作关系， 首先通过 PCR 克隆AGO2和AMC1 基因，并将其分别插入到植物表达载体PEG202和PFH中，通过农杆菌GV3101转化后注射到本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中，提取烟草中瞬时表达的蛋白，通过 Western blot 检测，确定蛋白的表达和互作情况[8]。
本实验通过TRIzol法提取拟南芥总RNA，RTPCR反转录得到CDNA，PCR进行基因扩增，构建中间载体，为以后的表达载体，western检测和COIP验证做好前提实验准备。
1??实验材料
1.1 植物
生长五个星期的拟南芥；
1.2?引物
根据以下原则设计用于扩增AMC1基因的特异引物。
1)长度15—30bp，有效长度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度，降低产物的特异性。
2)G十c含量应在45％一55％之间。
3)应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
4）引物自身不能含有自身互补序列，否则易形成发卡结构。
5）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，否则易形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6）引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应。因此，引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。
7）某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注
2B6 AMC1pENTR forward CACC ATGTACCCGCCACCTCCCTCA
2B7 AMC1Reverse CTA GAG AGT GAA AGG CTT TGC
1.3 质粒和菌株
大肠杆菌 (Escherichia coli )JM109；农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101 ；克隆载体 pENTR；植物表达载体PEG202；植物表达载体PFH；AGO2的表达载体；
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1实验材料 2
1.1植物 2
1.2引物2
1.3质粒和菌株 2
1.4试剂2
2实验方法 3
2.1拟南芥总RNA提取 3
2.2RTPCR反转录得到CDNA 4
2.3扩增目的基因 4
2.4中间载体 5
3 分析与讨论 6
致谢 7
参考文献7
拟南芥AtMC1基因的克隆及载体的构建
引言
近年来,德国、英国、美国3个实验室,利用生物信息学、cDNA文库及分子克隆技术,在不同生物体细胞中克隆到包括lin4和let7在内的约150个21～25个核苷酸的非编码小分子RNA[1]。这些RNA具有极强的调控作用,与生物体的阶段性发育密切相关,并意识到这是一个极为广阔的小分子RNA世界[2]。
小RNA是一类新发现的长度为21~25个核苷酸的小分子RNA,它普遍存在于真核生物中,占整个基因组基因总数的2%左右。小RNA是重要的调控RNA分子,它可直接调控某些基因的开关,从而控制细胞的生长发育,并决定细胞分化的组织类型[3]。根据小RNA的生长、结构和功能大约可分为3类：small interfering RNA（siRNA）、microRNA（miRNA)和其他小RNA。小RNA在生物进化过程中高度保守,并已被证实参与和调控包括时序发育、细胞凋亡、神经元发育、激素分泌等在内的多种生理过程[4]。
迄今，在拟南芥基因组中已发现了200多个miRNA基因，在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
水稻中发现的miRNA基因达到400个。研究表明，同编码基因一样，miRNA基因也通过RNA聚合酶II转录，产生miRNA的初级转录产物（primiRNA）。多数primiRNA和编码基因的转录本一样，具有 3＇polyA和 5＇帽子结构，部分primiRNA中还含有内含子[5]。
由小RNA诱导的沉默复合体（RNAinduced silencing complex,RISC）可特异的切割或抑制靶标mRNA的翻译。RNA沉默复合体包括许多部分，如RNA聚合酶、Dicer酶、Argonaute蛋白（AGO）、RNA依赖的RNA聚合酶（RdRPs）等[6]。拟南芥总共编码10种AGO蛋白，其中AGO2在植物抗病免疫中发挥重要作用[7]。为了深入研究AGO2在植物抗病中的作用机制，本实验前期已利用COIP和LCMS/MS鉴定与拟南芥AGO2互作的蛋白，并通过测序和表达谱分析，选取差异表达显著的AMC1蛋白，并进行以下的实验研究。
为了验证拟南芥AGO2蛋白和AMC1蛋白之间的互作关系， 首先通过 PCR 克隆AGO2和AMC1 基因，并将其分别插入到植物表达载体PEG202和PFH中，通过农杆菌GV3101转化后注射到本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中，提取烟草中瞬时表达的蛋白，通过 Western blot 检测，确定蛋白的表达和互作情况[8]。
本实验通过TRIzol法提取拟南芥总RNA，RTPCR反转录得到CDNA，PCR进行基因扩增，构建中间载体，为以后的表达载体，western检测和COIP验证做好前提实验准备。
1??实验材料
1.1 植物
生长五个星期的拟南芥；
1.2?引物
根据以下原则设计用于扩增AMC1基因的特异引物。
1)长度15—30bp，有效长度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度，降低产物的特异性。
2)G十c含量应在45％一55％之间。
3)应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
4）引物自身不能含有自身互补序列，否则易形成发卡结构。
5）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，否则易形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6）引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应。因此，引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。
7）某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注
2B6 AMC1pENTR forward CACC ATGTACCCGCCACCTCCCTCA
2B7 AMC1Reverse CTA GAG AGT GAA AGG CTT TGC
1.3 质粒和菌株
大肠杆菌 (Escherichia coli )JM109；农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101 ；克隆载体 pENTR；植物表达载体PEG202；植物表达载体PFH；AGO2的表达载体；
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