寿光蔬菜病毒病鉴定
本试验对山东寿光地区二十份蔬菜病毒病样品进行分子鉴定,结果证明山东寿光地区蔬菜感染的病毒为番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)。根据已经鉴定出ToCV的样品构建相应的原核表达载体，并在宿主大肠杆菌中诱导表达。通过 RT-PCR方法扩增获得番茄褪绿病毒的衣壳蛋白( CP) 基因，通过BamHI和XHoI这两个酶切位点插入到pET28a载体，构建获得原核表达重组载体pET328a-ToCV，转化到宿主菌株Rosetta中，经IPTG诱导后，SDS-PAGE 检测目的基因的表达情况。研究结果表明，成功构建了该基因的原核表达载体，目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将指导我们进行接下来的抗体血清的制备，为ToCV的检测及CP功能的研究奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
第一章 寿光地区蔬菜上病毒病的鉴定 3 1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1供试病毒样品 3
1.1.2菌株和载体 3
1.1.3生化及分子生物学试剂 3
1.2方法 3
1.2.1感病样品总RNA的提取 3
1.2.2RTPCR扩增3
1.2.3PCR产物纯化4
1.2.4目的片段和载体的连接5
1.2.5质粒的转化 5
1.2.6 菌落PCR鉴定重组质粒 5
1.2.7测序及分析 5
2结果与分析5
2.1样品检测 5
2.2序列分析 6
3讨论 6
第二章ToCV原核表达载体的构建6
1材料与方法 6
1.1材料 6
1.1.1 菌株、ToCV片段和载体 7
1.1.2生化及分子生物学试剂 7
1.2方法 7
1.2.1目的载体的回收 7
1.2.2目的片段的扩增与回收7
1.2.3目的片段和载体酶切并回收 8
1.2.4目的片段和载体的连 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
接和转化8
1.2.5菌落PCR并提取阳性菌株的质粒 8
1.2.6 PCR验证 8
1.2.7 PCR扩增并送测分析 9
2结果与分析9
2.1样品检测 9
2.2序列分析 9
3 讨论 9第三章 原核表达和抗体的制备 10
1材料与方法10
1.1材料10
1.1.1表达载体和菌株10
1.1.2生化及分子生物学试剂10
1.2方法10
1.2.1表达菌株的获得10
1.2.2蛋白表达预实验10
1.2.3蛋白存在于上清的大量表达11
2结果与分析11
3讨论 12
致谢13
参考文献14
山东寿光蔬菜病毒病鉴定
引言
引言
我国是世界上主要蔬菜生产国、消费国和出口国，蔬菜是我国仅次于粮食的第二大作物。有“中国蔬菜之乡”美誉的山东寿光，凭借着科学的种植技术和高产量、高品质的蔬菜成为我国最大的蔬菜生产和集散地[1]。而近两年，山东寿光地区的茄科类作物，尤其是番茄发生一种疑似缺素症状的病害，俗称“黄头”，给番茄生产造成严重损失，给番茄种植户带来了巨大的损失。后经人利用分子生物学技术进行检测，确定该病害为番茄褪绿病毒[2]。
番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）侵染番茄引起番茄褪绿病毒病。导致番茄叶片脉间黄化，部分区域变红，发育受阻，轻微卷曲，通常在老叶上表现明显，
新生枝条和叶片表现正常， 随着病害发展，发生脉间坏死 叶片变脆易碎、 叶片变厚，叶片光合作用显著降低，果实变小，产量和品质明显下降。ToCV已给当地番茄生产造成了严重危害， 受害番茄产量降低60%，单价降低50%，成为我国番茄生产中又一重要病毒[3]。
ToCV属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus）成员，基因组为二分体正义单链RNA，总长15.3~16kb，编码多种病毒蛋白，其中RNA1上主要编码复制相关蛋白（RNAdependent RNA polymerase，RdRp），RNA2上主要编码病毒衣壳蛋白(Capsid Protein，CP)。该病毒不能通过机械摩擦传毒，只能依靠媒介昆虫粉虱传播，包括温室白粉虱( Trialeurodes vaporariorum)、纹翅粉虱( Trialeurodes abutilonea) 和烟粉虱( Bemisia tabaci) ( 包括A 型和B 型)[4]。常见的寄主包括茄科（番茄、甜椒、烟草等）、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等多种植物［5］。传播ToCV 的媒介昆虫如烟粉虱等寄主范围十分广泛，可以在不同病毒植株和健康植株之间扩散， 加快了该病毒的蔓延危害[6]。ToCV传播迅速，成为我国番茄生产中又一重要病毒，防控形势严峻。
该病毒最早于1998年在美国佛罗里达州发现[7]，而后在法国、意大利、巴西、以色列等世界各地相继发现，目前已蔓延至世界多地。目前，除大洋洲和南极洲未见报道外，其余各洲均报道有ToCV 发生。我国对于该病毒，首先于2004年在台湾报道 [8]，2013年赵汝娜等人在北京先后在番茄[9]和辣椒[10]上分别发现并鉴定了该病毒。随后赵黎明等人又在山东检测到了该病毒，首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染[11]。同年，他们又检测到山东设施地区番茄受到番茄褪绿病毒及番茄黄化曲叶病毒两种病毒的复合侵染[12]，表明番茄褪绿病毒可与其他病毒协同作用造成复合侵染。随后，在我国天津、河北设施、河南省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地均有关于番茄褪绿病毒的报道。
目前，国内针对该病毒的诊断主要通过症状观察，并结合RTPCR等分子生物学方法。除了这两种方法之外，血清学检测技术也可应用于ToCV 的检测，但目前尚未在国内应用［13］。而相对于上面的两种方法，血清学检测技术具有灵敏度高、特异性强 、操作简单等优点，因此对于番茄褪绿病毒的血清学检测技术的发展势在必行。
现在，我们在前人的基础上，对山东寿光地区疑似感染ToCV的样品进行鉴定，看其所感染的病害是否为番茄褪绿病毒，以了解目前该地区ToCV的发生情况，是否发生变异产生新的变种等，为该地区的番茄病害防治提供理论依据。随后我们在鉴定出病毒的基础上，构建相应的载体，进行原核表达，制备抗体。为今后ToCV病毒的血清学快速检测技术的应用奠定基础，弥补目前国内在ToCV病毒鉴定的血清学技术方面的空缺。
第一章 寿光地区蔬菜上病毒病的鉴定
1 材料与方法
1．1 材料
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
第一章 寿光地区蔬菜上病毒病的鉴定 3 1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1供试病毒样品 3
1.1.2菌株和载体 3
1.1.3生化及分子生物学试剂 3
1.2方法 3
1.2.1感病样品总RNA的提取 3
1.2.2RTPCR扩增3
1.2.3PCR产物纯化4
1.2.4目的片段和载体的连接5
1.2.5质粒的转化 5
1.2.6 菌落PCR鉴定重组质粒 5
1.2.7测序及分析 5
2结果与分析5
2.1样品检测 5
2.2序列分析 6
3讨论 6
第二章ToCV原核表达载体的构建6
1材料与方法 6
1.1材料 6
1.1.1 菌株、ToCV片段和载体 7
1.1.2生化及分子生物学试剂 7
1.2方法 7
1.2.1目的载体的回收 7
1.2.2目的片段的扩增与回收7
1.2.3目的片段和载体酶切并回收 8
1.2.4目的片段和载体的连 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
接和转化8
1.2.5菌落PCR并提取阳性菌株的质粒 8
1.2.6 PCR验证 8
1.2.7 PCR扩增并送测分析 9
2结果与分析9
2.1样品检测 9
2.2序列分析 9
3 讨论 9第三章 原核表达和抗体的制备 10
1材料与方法10
1.1材料10
1.1.1表达载体和菌株10
1.1.2生化及分子生物学试剂10
1.2方法10
1.2.1表达菌株的获得10
1.2.2蛋白表达预实验10
1.2.3蛋白存在于上清的大量表达11
2结果与分析11
3讨论 12
致谢13
参考文献14
山东寿光蔬菜病毒病鉴定
引言
引言
我国是世界上主要蔬菜生产国、消费国和出口国，蔬菜是我国仅次于粮食的第二大作物。有“中国蔬菜之乡”美誉的山东寿光，凭借着科学的种植技术和高产量、高品质的蔬菜成为我国最大的蔬菜生产和集散地[1]。而近两年，山东寿光地区的茄科类作物，尤其是番茄发生一种疑似缺素症状的病害，俗称“黄头”，给番茄生产造成严重损失，给番茄种植户带来了巨大的损失。后经人利用分子生物学技术进行检测，确定该病害为番茄褪绿病毒[2]。
番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）侵染番茄引起番茄褪绿病毒病。导致番茄叶片脉间黄化，部分区域变红，发育受阻，轻微卷曲，通常在老叶上表现明显，
新生枝条和叶片表现正常， 随着病害发展，发生脉间坏死 叶片变脆易碎、 叶片变厚，叶片光合作用显著降低，果实变小，产量和品质明显下降。ToCV已给当地番茄生产造成了严重危害， 受害番茄产量降低60%，单价降低50%，成为我国番茄生产中又一重要病毒[3]。
ToCV属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus）成员，基因组为二分体正义单链RNA，总长15.3~16kb，编码多种病毒蛋白，其中RNA1上主要编码复制相关蛋白（RNAdependent RNA polymerase，RdRp），RNA2上主要编码病毒衣壳蛋白(Capsid Protein，CP)。该病毒不能通过机械摩擦传毒，只能依靠媒介昆虫粉虱传播，包括温室白粉虱( Trialeurodes vaporariorum)、纹翅粉虱( Trialeurodes abutilonea) 和烟粉虱( Bemisia tabaci) ( 包括A 型和B 型)[4]。常见的寄主包括茄科（番茄、甜椒、烟草等）、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等多种植物［5］。传播ToCV 的媒介昆虫如烟粉虱等寄主范围十分广泛，可以在不同病毒植株和健康植株之间扩散， 加快了该病毒的蔓延危害[6]。ToCV传播迅速，成为我国番茄生产中又一重要病毒，防控形势严峻。
该病毒最早于1998年在美国佛罗里达州发现[7]，而后在法国、意大利、巴西、以色列等世界各地相继发现，目前已蔓延至世界多地。目前，除大洋洲和南极洲未见报道外，其余各洲均报道有ToCV 发生。我国对于该病毒，首先于2004年在台湾报道 [8]，2013年赵汝娜等人在北京先后在番茄[9]和辣椒[10]上分别发现并鉴定了该病毒。随后赵黎明等人又在山东检测到了该病毒，首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染[11]。同年，他们又检测到山东设施地区番茄受到番茄褪绿病毒及番茄黄化曲叶病毒两种病毒的复合侵染[12]，表明番茄褪绿病毒可与其他病毒协同作用造成复合侵染。随后，在我国天津、河北设施、河南省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地均有关于番茄褪绿病毒的报道。
目前，国内针对该病毒的诊断主要通过症状观察，并结合RTPCR等分子生物学方法。除了这两种方法之外，血清学检测技术也可应用于ToCV 的检测，但目前尚未在国内应用［13］。而相对于上面的两种方法，血清学检测技术具有灵敏度高、特异性强 、操作简单等优点，因此对于番茄褪绿病毒的血清学检测技术的发展势在必行。
现在，我们在前人的基础上，对山东寿光地区疑似感染ToCV的样品进行鉴定，看其所感染的病害是否为番茄褪绿病毒，以了解目前该地区ToCV的发生情况，是否发生变异产生新的变种等，为该地区的番茄病害防治提供理论依据。随后我们在鉴定出病毒的基础上，构建相应的载体，进行原核表达，制备抗体。为今后ToCV病毒的血清学快速检测技术的应用奠定基础，弥补目前国内在ToCV病毒鉴定的血清学技术方面的空缺。
第一章 寿光地区蔬菜上病毒病的鉴定
1 材料与方法
1．1 材料
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