大豆对大豆花叶病毒抗病基因rsc18a的功能分析
大豆花叶病毒对大豆产量和品质影响极为严重，通过对大豆花叶病毒抗病基因的功能分析，为今后的大豆抗病育种奠定基础。以科丰1号、南农1138-2和SMV SC8株系为材料，通过RT-PCR、PCR扩增和QRT-PCR分析，结果表明候选基因Glyma.02G127900和Glyma.02G128000（包括Glyma.02G128100)的编码序列在抗、感亲本及Williams 82间是保守的，其他3个候选基因在抗、感亲本或Williams82间都存在一定的SNP等差异；经SMART在线数据库预测，Glyma.02G127800属于RLK调控的免疫反应的共调控因子亚类，基因Glyma.02G128000 (GmSAMDC1, AF488307)被证明可以响应盐害、干旱、冷害等胁迫，基因Glyma.02G128200是异黄酮等次级代谢途径的关键调控酶类，基因Glyma.02G128300与质膜形成相关；Rsc18A抗病候选基因的表达分析显示，基因Glyma.02G127800在科丰1号2 hpi 和 9 hpi 的表达量相对南农1138-2显著上调；基因Glyma.02G128000在南农1138-2中2hpi的表达量相对科丰1号显著上调； 基因Glyma.02G128200在抗、感亲本间的表达模式基本相同，但南农1138-2似乎能更早响应SMV的表达；基因Glyma.02G128300在抗、感亲本间的表达模式基本相同，但科丰1号在1hpi的表达量相对南农1138-2显著上调。
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT: 1
KEYWORDS: 1
引言 1
1.材料和方法 2
1.1 供试材料 2
1.2 生化试剂 2
1.3 引物合成及测序 2
1.4所用培养基与溶液 2
1.5 试验所需主要仪器 3
1.6 接种方法 3
1.7 总RNA的提取 3
1.8 CDNA第一链的合成 3
1.9 引物设计与PCR扩增反应 3
1.14 候选基因系统进化树的构建 4
1.15 QRTPCR分析 4
1.15.1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
PCR扩增 4
1.15.2 数据分析 5
1.16亚细胞定位的载体构建 5
1.17 农杆菌介导的烟草瞬时转化 6
2.结果与分析 6
2.1 大豆叶片总RNA的提取 6
2.3 克隆得到的目的片段回收后的检测 6
2.4 含有目的片段的菌液检测 6
2.5 候选基因的序列分析 7
2.6 SMV诱导的抗病候选基因的QRTPCR表达分析 9
2.7 候选基因克隆 9
2.8 亚细胞定位 10
3．讨论 10
致谢 11
参考文献: 12
附录A 12
附录B 13
附录C 13
附录D 14
附录E 14
附表1 14
大豆对大豆花叶病毒抗病基因Rsc18A的功能分析
引言
引言：大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus，SMV）病是众多大豆病毒病害中影响最大、地域分布最广的病害[12]。目前为止，人们已经定位了一些与SMV抗性相关的基因，并开展了抗病基因的标记辅助选择[3]。然而，从现有的文献报道可以看出，人们就抗性品种对SMV的抗病机制还知之甚少，大豆对SMV抗病基因的克隆研究还很薄弱，迄今尚未有功能性大豆抗病基因被克隆的报道[4]。
随着结构基因组学、功能基因组学、依据同源序列进行克隆等方法的发展及大豆基因组序列数据的公布(http://www.phytozome.net/soybean)，在大豆上开展候选基因的克隆已切实可行[5] 。同时，对植物抗病基因而言，一般具有的结构特征及参与的代谢反应，或是可能的信号防卫系统引起的一些防卫基因[5]，在各物种中有一定的共性，也是开展候选基因分析的有效前提。
前人选用在亲本科丰1号和南农11382间具有多态性的45个SSR标记[67]，用这些标记对科丰1号×南农11382的F2群体（180个F2单株）和RIL群体（435家系）进行筛选，利用Joinmap4.0进行连锁分析和作图，将抗病基因Rsc18A定位在D1b连锁群上SSR标记BARCSOYSSR_02_0667和BARCSOYSSR_02_0770之间 的87.3kb区间内，预测有6个基因[8]。本研究在此基础上，对这6个基因进行克隆测序分析和功能预测，寻找不同候选基因在科丰1号与南农11382这2个亲本间DNA序列上的差异，以便为今后的精细定位和抗病基因功能验证奠定基础。进一步鉴别Rsc18A的抗病候选基因，根据序列比对结果选定基因Glyma.02G127800，Glyma.02G128000，Glyma.02G128200和Glyma.02G128300通过QRTPCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，QRTPCR）和亚细胞定位进行表达模式分析，为进一步分离SMV抗性基因提供帮助。
1.材料和方法
1.1 供试材料
科丰1号、南农11382及SMV株系SC18，本氏烟草（N. benthamian）； 均由大学国家大豆改良中心提供。
大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态购自北京天根生物试剂公司，农杆菌感受态细胞EHA105由本实验室保存；克隆载体 pMD19T 购自TaKaRa 公司。瞬时表达载体pHBT95::GFP由本实验室保存。
1.2 生化试剂
植物总RNA提取试剂盒、DNA Marker购自北京天根生物试剂公司；Clon ExpressTM II One Step Cloning Kit同源置换酶购自Vazyme公司；Ex Taq扩增酶及PCR组分、PrimeScript? RT reagent Kit试剂盒、SYBR?Premix Ex Taq?购自TAKARA公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司；KOD FX扩增酶及PCR组分购自TOYOBO公司；限制性内切酶购自NEB公司。克隆所用的载体pMD19T Vector、Ex Taq HS DNA扩增酶、AMV反转录酶、DNA Marker购于TaKaRa公司；用于遗传转化的大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株DH5α、RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于北京天根公司；Amp购于北京鼎国公司；其它化学药品为国产分析纯。
1.3 引物合成及测序
引物的合成与测序由深圳华大科技股份有限公司完成。
1.4所用培养基与溶液
LB培养基(1000ml)、氨苄青霉素(100mg/ml)、50×TAE和磷酸缓冲液(2500 ml)
1.5 试验所需主要仪器
智能型光照培养箱、超净工作台、离心机、水浴锅、恒温摇床、PCR仪、琼脂糖凝胶成像系统、高压灭菌锅等。
1.6 接种方法
在防虫网室内将SMV株系SC18繁殖在感病材料南农11382上，待毒源充足后将试验的大豆抗感品种种植于防虫网室中，出苗后去除种传病苗，在第一对真叶完全展开时分别在相应的品种上人工摩擦接种SMV两个株系，以磷酸缓冲液接种的样品为对照。在接种后0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48，72 小时 和 9 天后取样，后液氮速冻，在80℃冰箱中保存以备进行QRTPCR分析。
1.7 总RNA的提取
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT: 1
KEYWORDS: 1
引言 1
1.材料和方法 2
1.1 供试材料 2
1.2 生化试剂 2
1.3 引物合成及测序 2
1.4所用培养基与溶液 2
1.5 试验所需主要仪器 3
1.6 接种方法 3
1.7 总RNA的提取 3
1.8 CDNA第一链的合成 3
1.9 引物设计与PCR扩增反应 3
1.14 候选基因系统进化树的构建 4
1.15 QRTPCR分析 4
1.15.1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
PCR扩增 4
1.15.2 数据分析 5
1.16亚细胞定位的载体构建 5
1.17 农杆菌介导的烟草瞬时转化 6
2.结果与分析 6
2.1 大豆叶片总RNA的提取 6
2.3 克隆得到的目的片段回收后的检测 6
2.4 含有目的片段的菌液检测 6
2.5 候选基因的序列分析 7
2.6 SMV诱导的抗病候选基因的QRTPCR表达分析 9
2.7 候选基因克隆 9
2.8 亚细胞定位 10
3．讨论 10
致谢 11
参考文献: 12
附录A 12
附录B 13
附录C 13
附录D 14
附录E 14
附表1 14
大豆对大豆花叶病毒抗病基因Rsc18A的功能分析
引言
引言：大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus，SMV）病是众多大豆病毒病害中影响最大、地域分布最广的病害[12]。目前为止，人们已经定位了一些与SMV抗性相关的基因，并开展了抗病基因的标记辅助选择[3]。然而，从现有的文献报道可以看出，人们就抗性品种对SMV的抗病机制还知之甚少，大豆对SMV抗病基因的克隆研究还很薄弱，迄今尚未有功能性大豆抗病基因被克隆的报道[4]。
随着结构基因组学、功能基因组学、依据同源序列进行克隆等方法的发展及大豆基因组序列数据的公布(http://www.phytozome.net/soybean)，在大豆上开展候选基因的克隆已切实可行[5] 。同时，对植物抗病基因而言，一般具有的结构特征及参与的代谢反应，或是可能的信号防卫系统引起的一些防卫基因[5]，在各物种中有一定的共性，也是开展候选基因分析的有效前提。
前人选用在亲本科丰1号和南农11382间具有多态性的45个SSR标记[67]，用这些标记对科丰1号×南农11382的F2群体（180个F2单株）和RIL群体（435家系）进行筛选，利用Joinmap4.0进行连锁分析和作图，将抗病基因Rsc18A定位在D1b连锁群上SSR标记BARCSOYSSR_02_0667和BARCSOYSSR_02_0770之间 的87.3kb区间内，预测有6个基因[8]。本研究在此基础上，对这6个基因进行克隆测序分析和功能预测，寻找不同候选基因在科丰1号与南农11382这2个亲本间DNA序列上的差异，以便为今后的精细定位和抗病基因功能验证奠定基础。进一步鉴别Rsc18A的抗病候选基因，根据序列比对结果选定基因Glyma.02G127800，Glyma.02G128000，Glyma.02G128200和Glyma.02G128300通过QRTPCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，QRTPCR）和亚细胞定位进行表达模式分析，为进一步分离SMV抗性基因提供帮助。
1.材料和方法
1.1 供试材料
科丰1号、南农11382及SMV株系SC18，本氏烟草（N. benthamian）； 均由大学国家大豆改良中心提供。
大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态购自北京天根生物试剂公司，农杆菌感受态细胞EHA105由本实验室保存；克隆载体 pMD19T 购自TaKaRa 公司。瞬时表达载体pHBT95::GFP由本实验室保存。
1.2 生化试剂
植物总RNA提取试剂盒、DNA Marker购自北京天根生物试剂公司；Clon ExpressTM II One Step Cloning Kit同源置换酶购自Vazyme公司；Ex Taq扩增酶及PCR组分、PrimeScript? RT reagent Kit试剂盒、SYBR?Premix Ex Taq?购自TAKARA公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司；KOD FX扩增酶及PCR组分购自TOYOBO公司；限制性内切酶购自NEB公司。克隆所用的载体pMD19T Vector、Ex Taq HS DNA扩增酶、AMV反转录酶、DNA Marker购于TaKaRa公司；用于遗传转化的大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株DH5α、RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于北京天根公司；Amp购于北京鼎国公司；其它化学药品为国产分析纯。
1.3 引物合成及测序
引物的合成与测序由深圳华大科技股份有限公司完成。
1.4所用培养基与溶液
LB培养基(1000ml)、氨苄青霉素(100mg/ml)、50×TAE和磷酸缓冲液(2500 ml)
1.5 试验所需主要仪器
智能型光照培养箱、超净工作台、离心机、水浴锅、恒温摇床、PCR仪、琼脂糖凝胶成像系统、高压灭菌锅等。
1.6 接种方法
在防虫网室内将SMV株系SC18繁殖在感病材料南农11382上，待毒源充足后将试验的大豆抗感品种种植于防虫网室中，出苗后去除种传病苗，在第一对真叶完全展开时分别在相应的品种上人工摩擦接种SMV两个株系，以磷酸缓冲液接种的样品为对照。在接种后0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48，72 小时 和 9 天后取样，后液氮速冻，在80℃冰箱中保存以备进行QRTPCR分析。
1.7 总RNA的提取
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