农杆菌介导的玉米遗传转化研究
人们日益增多的玉米需求量以及越来越高玉米品质期望要求，其遗传转化研究具有明显的应用和理论意义。关于玉米转基因，目前大多数实验室、生物技术公司更多采用农杆菌介导法。这也使它成为目前玉米遗传转化研究主流方法之一。农杆菌介导的玉米的遗传转化研究对于玉米转基因具有重要意义，本文综述了农杆菌介导玉米研究的发展和农杆菌介导玉米幼胚外部条件变化对介导的影响以及农杆菌介导的未来展望。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1材料与方法4
1.1实验材料4
1.1.1植物材料 4
1.1.2菌株与质粒4
1.1.3主要仪器和试剂4
1.1.4主要培养基4
1.2农杆菌介导的玉米幼胚转化5
1.2.1 玉米幼胚的侵染和共培养5
1.2.2玉米的恢复培养和筛选培养5
2结果与分析5
2.1不同幼胚大小对GUS瞬时表达率的影响5
2.2不同共培养时间对GUS 瞬时表达率的影响6
2.3不同幼胚的侵染部位对GUS 瞬时表达率的影响6
3讨论7
4研究展望8
致谢8
参考文献9
表一 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化所使用的培养基4
表二 幼胚不同部位的GUS 瞬时表达率7
图1(左)图2（右） GUS对农杆菌转化幼胚的染色5
图3 不同幼胚大小对遗传转化率的影 6
图4 不同共培养时间对遗传转化率的影响6
图5（左），图6（中），图7（右），幼胚不同部位GUS 瞬时表达 7
农杆菌介导的玉米遗传转化研究
引言
引言
玉米（Zea mays L.）是世界上最重要的谷类作物之一，1998年后, 玉米已超过水稻和小麦成为全球第一大作物其种植面积目前已跃居第一位[1]，据相关研究推测,到 2020年世界玉米需求量将达到 7.53亿 t, 届时中国玉米需求量为 2.14亿t[2]，玉米的抗虫，抗病
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
，增产等已成为重要的研究方向。随着生物技术的不断发展，抗病、抗旱、耐盐等转基因研究取得了显著进展，并展现出良好的应用前景，转基因技术使优良的基因在动植物和微生物之间进行交流 , 弥补某些遗传资源的不足 , 丰富种质库, 自1996年开始商业化种植转基因玉米以来, 全世界转基因玉米种植面积 30万公顷, 占全球玉米种植总面积 1.41 亿公顷的 0.2%,到2007年截止11年的时间里 , 全世界转基因玉米种植面积已经达到3520 万公顷,占全球玉米种植总面积 1.47 亿公顷的24%,种植转基因玉米的国家已经发展到 15 个[3],而关于玉米转基因的，目前大多数实验室、生物技术公司更多采用农杆菌介导法。这也使它成为目前玉米遗传转化研究主流方法之一[4], 农杆菌介导的玉米的遗传转化研究对于玉米转基因具有重要意义。
农杆菌是从土壤中分离出来的革兰氏阴性细菌,玉米不是农杆菌的天然宿主，因此农杆菌介导玉米转化难度较大，最初农杆菌遗传转化研究进展缓慢。随着人们对农杆菌侵染机制的进一步了解和转化技术的不断改进完善, 农杆菌介导的遗传转化在玉米中不断取得进展,玉米遗传转化所采用的外植体种类越来越广泛，其中生长旺盛的玉米幼胚和幼穗的再生能力明显高于其他部位。自从 Ishida 等[5]用含超双元载体的农杆菌转化玉米幼胚 A188 获得成功以来，国内许多研究人员采用幼胚作为转化受体，对影响农杆菌介导玉米幼胚遗传转化的因素进行了研究 [6,7]。
农杆菌介导转化玉米幼胚是一个复杂过程，本文就实验中农杆菌、玉米幼胚受体及培养环境多方面各种相互作用的因素对农杆菌介导幼胚影响做以综述。农杆菌本身而言就存在农杆菌菌液浓度，农杆菌侵染方式等因素的影响；幼胚方面存在幼胚大小，侵染时间等因的影响；培养环境方面存在外部温度和培养环境隔绝外部污染因素等方面的影响。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本实验所包含的所有玉米幼配材料均采集于玉米活体植株上，不存在长时间冷冻造成的玉米幼胚活性降低的情况，符合农杆菌介导玉米实验要求。
1．1．2菌株与质粒
根癌农杆菌（Agorbacetriumu tmaefaciens）EHA105 由本实验室保存，质粒为pGM626含有UbiGUSbarNOS,rd29ATPS1NOS 和35SVlmybA2NOS 表达元件的植物表达载体（图1）。
图1 TDNA区域示意图
1．1．3 主要仪器和试剂
高速离心机、离心机、恒温培养箱、超净工作台、光照培养箱、高压灭菌锅、螺旋搅拌器、恒温摇床
1．1．4主要培养基
实验中农杆菌介导玉米幼胚所使用的培养基如表一所示（固体培养基附加1.5%琼脂，液体培养基不加琼脂。）
表一 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化所使用的培养基
培养基名称
培养基成分
农杆菌重悬液
共培培养基
4g/LN6 salts and vitamins, 1.5mg/L2,4D, 0.7g/LLproline, 68.4g/L sucrose, 36 g/LGlucose ,100 μmol/LAS, pH 5.2.
4g/LN6 salts and vitamins, 1.5mg/L2,4D, 0.7g/LLproline, 30g/L sucrose, 300mg/Lcysteine, 3g/L Gelrite, pH 5.8.
1.2 农杆菌介导的玉米幼胚转化
1．2．1 玉米幼胚的侵染和共培养
将收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，用小刀去掉雌穗的头尾部分;先将雌穗浸在75%乙醇中灭菌5min,然后浸在0.1%的升汞中灭菌10min;无菌水清洗涤3 次，置于无菌的环境中备用;用手术刀切去玉米籽粒的上半部分，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将幼胚挑出;将幼胚收集于灭过菌的离心管中，加入农杆菌重悬液，上下颠倒摇动侵染。将侵染后的幼胚倒在共培培养基上吸去重悬液，放在超净工作台上直至水渍消失，用刀片将幼胚盾片朝上放置于培养基上，放入20℃恒温箱黑暗培养3d。
1．2．2幼胚的恢复培养和筛选培养
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1材料与方法4
1.1实验材料4
1.1.1植物材料 4
1.1.2菌株与质粒4
1.1.3主要仪器和试剂4
1.1.4主要培养基4
1.2农杆菌介导的玉米幼胚转化5
1.2.1 玉米幼胚的侵染和共培养5
1.2.2玉米的恢复培养和筛选培养5
2结果与分析5
2.1不同幼胚大小对GUS瞬时表达率的影响5
2.2不同共培养时间对GUS 瞬时表达率的影响6
2.3不同幼胚的侵染部位对GUS 瞬时表达率的影响6
3讨论7
4研究展望8
致谢8
参考文献9
表一 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化所使用的培养基4
表二 幼胚不同部位的GUS 瞬时表达率7
图1(左)图2（右） GUS对农杆菌转化幼胚的染色5
图3 不同幼胚大小对遗传转化率的影 6
图4 不同共培养时间对遗传转化率的影响6
图5（左），图6（中），图7（右），幼胚不同部位GUS 瞬时表达 7
农杆菌介导的玉米遗传转化研究
引言
引言
玉米（Zea mays L.）是世界上最重要的谷类作物之一，1998年后, 玉米已超过水稻和小麦成为全球第一大作物其种植面积目前已跃居第一位[1]，据相关研究推测,到 2020年世界玉米需求量将达到 7.53亿 t, 届时中国玉米需求量为 2.14亿t[2]，玉米的抗虫，抗病
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
，增产等已成为重要的研究方向。随着生物技术的不断发展，抗病、抗旱、耐盐等转基因研究取得了显著进展，并展现出良好的应用前景，转基因技术使优良的基因在动植物和微生物之间进行交流 , 弥补某些遗传资源的不足 , 丰富种质库, 自1996年开始商业化种植转基因玉米以来, 全世界转基因玉米种植面积 30万公顷, 占全球玉米种植总面积 1.41 亿公顷的 0.2%,到2007年截止11年的时间里 , 全世界转基因玉米种植面积已经达到3520 万公顷,占全球玉米种植总面积 1.47 亿公顷的24%,种植转基因玉米的国家已经发展到 15 个[3],而关于玉米转基因的，目前大多数实验室、生物技术公司更多采用农杆菌介导法。这也使它成为目前玉米遗传转化研究主流方法之一[4], 农杆菌介导的玉米的遗传转化研究对于玉米转基因具有重要意义。
农杆菌是从土壤中分离出来的革兰氏阴性细菌,玉米不是农杆菌的天然宿主，因此农杆菌介导玉米转化难度较大，最初农杆菌遗传转化研究进展缓慢。随着人们对农杆菌侵染机制的进一步了解和转化技术的不断改进完善, 农杆菌介导的遗传转化在玉米中不断取得进展,玉米遗传转化所采用的外植体种类越来越广泛，其中生长旺盛的玉米幼胚和幼穗的再生能力明显高于其他部位。自从 Ishida 等[5]用含超双元载体的农杆菌转化玉米幼胚 A188 获得成功以来，国内许多研究人员采用幼胚作为转化受体，对影响农杆菌介导玉米幼胚遗传转化的因素进行了研究 [6,7]。
农杆菌介导转化玉米幼胚是一个复杂过程，本文就实验中农杆菌、玉米幼胚受体及培养环境多方面各种相互作用的因素对农杆菌介导幼胚影响做以综述。农杆菌本身而言就存在农杆菌菌液浓度，农杆菌侵染方式等因素的影响；幼胚方面存在幼胚大小，侵染时间等因的影响；培养环境方面存在外部温度和培养环境隔绝外部污染因素等方面的影响。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本实验所包含的所有玉米幼配材料均采集于玉米活体植株上，不存在长时间冷冻造成的玉米幼胚活性降低的情况，符合农杆菌介导玉米实验要求。
1．1．2菌株与质粒
根癌农杆菌（Agorbacetriumu tmaefaciens）EHA105 由本实验室保存，质粒为pGM626含有UbiGUSbarNOS,rd29ATPS1NOS 和35SVlmybA2NOS 表达元件的植物表达载体（图1）。
图1 TDNA区域示意图
1．1．3 主要仪器和试剂
高速离心机、离心机、恒温培养箱、超净工作台、光照培养箱、高压灭菌锅、螺旋搅拌器、恒温摇床
1．1．4主要培养基
实验中农杆菌介导玉米幼胚所使用的培养基如表一所示（固体培养基附加1.5%琼脂，液体培养基不加琼脂。）
表一 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化所使用的培养基
培养基名称
培养基成分
农杆菌重悬液
共培培养基
4g/LN6 salts and vitamins, 1.5mg/L2,4D, 0.7g/LLproline, 68.4g/L sucrose, 36 g/LGlucose ,100 μmol/LAS, pH 5.2.
4g/LN6 salts and vitamins, 1.5mg/L2,4D, 0.7g/LLproline, 30g/L sucrose, 300mg/Lcysteine, 3g/L Gelrite, pH 5.8.
1.2 农杆菌介导的玉米幼胚转化
1．2．1 玉米幼胚的侵染和共培养
将收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，用小刀去掉雌穗的头尾部分;先将雌穗浸在75%乙醇中灭菌5min,然后浸在0.1%的升汞中灭菌10min;无菌水清洗涤3 次，置于无菌的环境中备用;用手术刀切去玉米籽粒的上半部分，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将幼胚挑出;将幼胚收集于灭过菌的离心管中，加入农杆菌重悬液，上下颠倒摇动侵染。将侵染后的幼胚倒在共培培养基上吸去重悬液，放在超净工作台上直至水渍消失，用刀片将幼胚盾片朝上放置于培养基上，放入20℃恒温箱黑暗培养3d。
1．2．2幼胚的恢复培养和筛选培养
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