棉铃虫cry1ac抗性相关的钙粘蛋白突变体的共表达
棉铃虫钙粘蛋白基因（HaCad）的多种突变可以导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。前期的研究发现基于HaCad胞外区突变基因r1的棉铃虫品系SCD-r1 (r1r1)对Cry1Ac具有540倍抗性，基于HaCad胞质区突变基因r15的棉铃虫品系SCD-r15 (r15r15)对Cry1Ac具有140倍抗性，而SCD-r1和SCD-r15的杂交F1代(r1r15)对Cry1Ac具有910倍抗性，表现出杂交优势。本研究利用Sf9细胞对r1和r15等位基因进行了共表达，westernblot结果显示两个蛋白可同时被检测到，表明共表达成功。免疫荧光定位结果显示共表达蛋白能够与Cry1Ac结合。研究结果为探究钙粘蛋白突变互作与Cry1Ac毒力之间的关系提供了重要基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 钙粘蛋白共表达载体的构建 2
1.2 重组Bacmid的获得3
1.2.1 转座反应3
1.2.2 重组Bacmid的提取和Bacmid DNA的PCR鉴定3
1.3 重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染3
1.3.1 昆虫细胞的培养3
1.3.2 制备P1病毒液3
1.3.3 制备P2病毒液3
1.3.4 P3病毒液的制备与鉴定3
1.4 免疫荧光定位分析4
2 结果与分析4
2.1 重组质粒的鉴定4
2.2 重组蛋白在Sf9细胞中的表达5
2.2 重组蛋白在Sf9细胞中的表达5
3讨论7
致谢8
参考文献9
棉铃虫Cry1Ac抗性相关的钙粘蛋白突变体的共表达
引言
棉铃虫（Helicoverpa armigera）是一种多食性害虫，具有很强的繁殖能力和一定的迁飞能力，并且可以兼性滞育，这些生物学特性使得棉铃虫成为抗药性发生最严重的农业害虫之一（Wu和Guo, 2005）。我国自1997年开始推广种植表达Cry1Ac毒素蛋白的Bt棉花，Bt *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
棉花种植面积占棉花总种植面积的80%（张浩男, 2012）。Bt棉花的大规模种植不但有效控制了棉铃虫对棉花等多种寄主植物的为害，而且减少了化学杀虫剂的使用，保护了天敌昆虫，进而提升了农业生态系统的生物防治功能，带来了明显的经济、环境和社会效益（Lu et al., 2012）。
Bt棉花在我国的规模化种植使得靶标害虫棉铃虫的危害得到有效控制，但是，棉铃虫的抗性演化严重威胁着Bt棉花的可持续使用（Zhang et al., 2011; 2012a）。因此，棉铃虫田间种群对Bt棉花具有较高的抗性风险，必须加强对棉铃虫Bt抗性机理的研究，明确棉铃虫Bt抗性基因类型，开发高效的抗性基因检测技术。
2009年从田间棉铃虫种群中分离到一个对Bt毒素Cry1Ac产生不完全显性抗性的棉铃虫品系CYTO，研究发现该抗性是由钙粘蛋白胞质区缺失突变基因r15（胞质区缺失55个氨基酸）介导的。CYTO与敏感品系SCD经过多次杂交筛选形成SCDr15品系，相对于敏感品系，SCDr15对Cry1Ac产生140倍抗性。基于钙粘蛋白胞外区突变基因r1的棉铃虫品系SCDr1（r1r1）对Cry1Ac具有540倍抗性（Xu et al., 2005; Yang et al., 2007; Zhang et al., 2012b）。而SCDr1和SCDr15的杂交F1代（r1r15）对Cry1Ac具有910倍抗性，高于任一亲本（SCDr1或SCDr15）对Cry1Ac的抗性，并且其在Bt棉花上的生存能力也显著高于两个亲本。SCDr1和SCDr15互为近等基因系，只在HaCad位点及附近有差异，遗传背景一致，因此推测杂种一代表现出强于亲本的抗性是由于HaCad位点抗性等位基因互作形成的。
基于等位基因互作杂种优势的存在能够解释棉铃虫田间种群钙粘蛋突变为何具有多样性，并且HaCad位点不同抗性等位基因间的这种杂种优势现象有可能提高棉铃虫在抗虫棉上的适合度，从而加快棉铃虫田间种群Bt抗性的发展速度。因此，研究棉铃虫Bt抗性等位基因互作的分子和生化机理具有重要理论和实际意义。本文利用BactoBac真核细胞表达系统对r1和r15这两个突变基因进行了共表达，并分析了共表达蛋白与Cry1Ac的结合。研究结果将为揭示不同抗性突变体互作产生杂种优势的分子机理提供研究基础，并对于探索抗性发展规律具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 钙粘蛋白共表达载体的构建
利用SV总RNA提取试剂盒（Promega）分别提取抗性品系SCDr1（r1r1）和CYTO（r15r15）单头幼虫中肠总RNA，并合成cDNA。以SCDr1 cDNA为模板，利用上下游引物r1XhoⅠF（ccgctcgagatggcagtcgacgtgagaatattcacg）和r1SphⅠR（acatgcatgcttaagcaaagtcttctaagttcagtgtc）进行PCR扩增，获得钙粘蛋白突变基因r1开发阅读框序列全长。以CYTO cDNA为模板，利用上下游引物r15NotⅠF（ataagaatgcggccgcatggcagtcgacgtgagagtactgacg）和r15XbaⅠR（gctctagattatcttctgaactgtgtgttcgcg）进行PCR扩增，获得钙粘蛋白突变基因r15开发阅读框序列全长。XhoⅠ、SphⅠ、NotⅠ和XbaⅠ是酶切位点。PCR程序及体系参照PrimeSTAR? HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶说明书（TakaRa, DR0101S），PCR产物纯化利用Wizard? DNA纯化试剂盒进行。
pFastBac Dual载体（Invitrogrn，上海）含有polyhedrin（PH）和P10两个启动子，可以对外源基因进行共表达，因此采用分步构建法将两个基因分别组装。首先将突变基因r1组装到P10启动子一端。用XhoⅠ和SphⅠ对共表达载体pFastBac Dual和纯化的PCR产物进行双酶切，酶切反应体系见Fermentas公司说明书，参照Wizard? DNA纯化试剂盒说明书回收酶切产物。用T4 DNA连接酶（Promega）对经酶切回收后的目的基因和对应的双酶切载体进行连接，连接体系及条件见说明书。取连接反应产物10μl，转入100μl感受态细胞TOP10中，进行Amp抗性筛选，利用OMEGA质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，经测序获得pFastBac DualP10r1质粒。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 钙粘蛋白共表达载体的构建 2
1.2 重组Bacmid的获得3
1.2.1 转座反应3
1.2.2 重组Bacmid的提取和Bacmid DNA的PCR鉴定3
1.3 重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染3
1.3.1 昆虫细胞的培养3
1.3.2 制备P1病毒液3
1.3.3 制备P2病毒液3
1.3.4 P3病毒液的制备与鉴定3
1.4 免疫荧光定位分析4
2 结果与分析4
2.1 重组质粒的鉴定4
2.2 重组蛋白在Sf9细胞中的表达5
2.2 重组蛋白在Sf9细胞中的表达5
3讨论7
致谢8
参考文献9
棉铃虫Cry1Ac抗性相关的钙粘蛋白突变体的共表达
引言
棉铃虫（Helicoverpa armigera）是一种多食性害虫，具有很强的繁殖能力和一定的迁飞能力，并且可以兼性滞育，这些生物学特性使得棉铃虫成为抗药性发生最严重的农业害虫之一（Wu和Guo, 2005）。我国自1997年开始推广种植表达Cry1Ac毒素蛋白的Bt棉花，Bt *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
棉花种植面积占棉花总种植面积的80%（张浩男, 2012）。Bt棉花的大规模种植不但有效控制了棉铃虫对棉花等多种寄主植物的为害，而且减少了化学杀虫剂的使用，保护了天敌昆虫，进而提升了农业生态系统的生物防治功能，带来了明显的经济、环境和社会效益（Lu et al., 2012）。
Bt棉花在我国的规模化种植使得靶标害虫棉铃虫的危害得到有效控制，但是，棉铃虫的抗性演化严重威胁着Bt棉花的可持续使用（Zhang et al., 2011; 2012a）。因此，棉铃虫田间种群对Bt棉花具有较高的抗性风险，必须加强对棉铃虫Bt抗性机理的研究，明确棉铃虫Bt抗性基因类型，开发高效的抗性基因检测技术。
2009年从田间棉铃虫种群中分离到一个对Bt毒素Cry1Ac产生不完全显性抗性的棉铃虫品系CYTO，研究发现该抗性是由钙粘蛋白胞质区缺失突变基因r15（胞质区缺失55个氨基酸）介导的。CYTO与敏感品系SCD经过多次杂交筛选形成SCDr15品系，相对于敏感品系，SCDr15对Cry1Ac产生140倍抗性。基于钙粘蛋白胞外区突变基因r1的棉铃虫品系SCDr1（r1r1）对Cry1Ac具有540倍抗性（Xu et al., 2005; Yang et al., 2007; Zhang et al., 2012b）。而SCDr1和SCDr15的杂交F1代（r1r15）对Cry1Ac具有910倍抗性，高于任一亲本（SCDr1或SCDr15）对Cry1Ac的抗性，并且其在Bt棉花上的生存能力也显著高于两个亲本。SCDr1和SCDr15互为近等基因系，只在HaCad位点及附近有差异，遗传背景一致，因此推测杂种一代表现出强于亲本的抗性是由于HaCad位点抗性等位基因互作形成的。
基于等位基因互作杂种优势的存在能够解释棉铃虫田间种群钙粘蛋突变为何具有多样性，并且HaCad位点不同抗性等位基因间的这种杂种优势现象有可能提高棉铃虫在抗虫棉上的适合度，从而加快棉铃虫田间种群Bt抗性的发展速度。因此，研究棉铃虫Bt抗性等位基因互作的分子和生化机理具有重要理论和实际意义。本文利用BactoBac真核细胞表达系统对r1和r15这两个突变基因进行了共表达，并分析了共表达蛋白与Cry1Ac的结合。研究结果将为揭示不同抗性突变体互作产生杂种优势的分子机理提供研究基础，并对于探索抗性发展规律具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 钙粘蛋白共表达载体的构建
利用SV总RNA提取试剂盒（Promega）分别提取抗性品系SCDr1（r1r1）和CYTO（r15r15）单头幼虫中肠总RNA，并合成cDNA。以SCDr1 cDNA为模板，利用上下游引物r1XhoⅠF（ccgctcgagatggcagtcgacgtgagaatattcacg）和r1SphⅠR（acatgcatgcttaagcaaagtcttctaagttcagtgtc）进行PCR扩增，获得钙粘蛋白突变基因r1开发阅读框序列全长。以CYTO cDNA为模板，利用上下游引物r15NotⅠF（ataagaatgcggccgcatggcagtcgacgtgagagtactgacg）和r15XbaⅠR（gctctagattatcttctgaactgtgtgttcgcg）进行PCR扩增，获得钙粘蛋白突变基因r15开发阅读框序列全长。XhoⅠ、SphⅠ、NotⅠ和XbaⅠ是酶切位点。PCR程序及体系参照PrimeSTAR? HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶说明书（TakaRa, DR0101S），PCR产物纯化利用Wizard? DNA纯化试剂盒进行。
pFastBac Dual载体（Invitrogrn，上海）含有polyhedrin（PH）和P10两个启动子，可以对外源基因进行共表达，因此采用分步构建法将两个基因分别组装。首先将突变基因r1组装到P10启动子一端。用XhoⅠ和SphⅠ对共表达载体pFastBac Dual和纯化的PCR产物进行双酶切，酶切反应体系见Fermentas公司说明书，参照Wizard? DNA纯化试剂盒说明书回收酶切产物。用T4 DNA连接酶（Promega）对经酶切回收后的目的基因和对应的双酶切载体进行连接，连接体系及条件见说明书。取连接反应产物10μl，转入100μl感受态细胞TOP10中，进行Amp抗性筛选，利用OMEGA质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，经测序获得pFastBac DualP10r1质粒。
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