绿盲蝽毒死蜱抗性品系中p450基因相对表达量的变化
为明确细胞色素P450在绿盲蝽毒死蜱抗性中的作用，本文通过转录组测序技术分析了绿盲蝽毒死蜱抗性品系中细胞色素P450超基因家族的表达水平，同时利用实时定量PCR方法验证了相应P450基因的相对表达量。转录组数据分析表明在绿盲蝽体内共有75个P450基因，与敏感品系SLF和BZS相比，毒死蜱抗性品系BZR中共有6个P450基因表达量显著上升，分别为CYP6A20、CYP6A14、CYP6X1v1、CYP6B6、CYP6BS1、以及CYP4ac1。而实时定量PCR验证的结果则表明在BZR品系中仅CYP6B6、CYP6BS1、CYP6a20和CYP6X1v1基因的表达量明显提高，分别为SLF品系中的9.21、7.38、7.90和2.86倍，差异达到显著水平。因此可以推断，CYP6B6、CYP6BS1、CYP6a20和CYP6X1v1可能参与了绿盲蝽BZR品系毒死蜱抗性的形成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试昆虫 2
1.2 主要试剂和仪器2
1.2.1 主要试剂2
1.2.2 主要仪器设备2
1.3 试验方法2
1.3.1 转录组测序2
1.3.2 转录组数据分析2
1.3.3 绿盲蝽总RNA的提取3
1.3.4 RNA质量检测3
1.3.5 定量反转录3
1.3.6 荧光实时定量PCR3
2 结果与分析4
2.1 P450基因转录组测序结果4
2.2 P450基因定量PCR产物熔解曲线和扩增效率一致性分析5
2.3 P450基因表达量的定量验证5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
图 1 定量PCR扩增效率5
图2 P450基因在不同绿盲蝽品系中的相对表达量6
表1 引物信息4
表2 绿盲蝽转录组解毒酶基因数据分析4
表3 绿盲蝽转录组P450基因 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
数据分析5
绿盲蝽毒死蜱抗性品系中P450基因相对表达量的变化
引言
与其他生物体相同，昆虫细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450，P450/CYP/CYP P450) 也是多功能氧化酶系（mixed function oxidases，MFO)的末端氧化酶，可与底物结合以及从还原型辅酶Ⅱ（NADPH）传递电子到细胞色素P450还原酶，在MFO系统的氧化代谢功能中起核心作用。昆虫细胞色素P450不仅参与内源活性物质（如固醇类激素、脂类等）的合成及代谢过程，同时在杀虫剂、植物毒素等外源化合物的代谢中也起着重要作用（Feyereisen，2012)。
细胞色素P450底物广谱，可代谢不同结构的杀虫剂，由P450介导的解毒代谢增强是昆虫对有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和烟碱类等多种类型的杀虫剂产生抗性的重要机制(Estabrook, 1996)。昆虫对有机磷杀虫剂代谢能力的增强及抗性产生与抗性昆虫中细胞色素P450基因的过量表达密切相关。家蝇（Musca domestica）二嗪磷抗性品系Rutgers中cyp6a1 mRNA水平至少为敏感品系的10倍(Carino et al.，1994)；黑腹果蝇抗性品系91R中cyp6a2的表达水平是敏感品系的2030倍，这也是导致该品系对DDT和马拉硫磷产生高水平抗性的主要原因(Waters et al.，1992)；灰飞虱中3种P450基因CYP6AY3v2、CYP306A2v2、CYP353D1v2的过量表达，导致了其对毒死蜱的代谢抗性(Xu et al., 2014)。
绿盲蝽（Apolygus lucorum）属于半翅目(Heteroptera)盲蝽科(Miridae)，其寄主含棉花等50余科200多种植物，主要为害我国黄河流域的大部分棉田，是一类重要的农业害虫(萧采瑜和孟祥玲，1963；Lu等，2008)。近些年来，我国在防治盲蝽的过程中由于杀虫剂的过度及不合理使用已导致其对杀虫剂的敏感性降低，引致抗药性问题。山东省聊城、滨州绿盲蝽种群对灭多威、硫丹和氟虫腈的敏感性下降（Guo et al.，2010；张小兵等，2013），河南新乡、安徽无为、山东滨州绿盲蝽种群对马拉硫磷、三氟氯氰菊酯和硫丹产生低水平抗性（谭瑶等，2012），2011至2014年间，黄河流域棉区的滨州及沧州种群对毒死蜱已产生中等水平抗性（1120倍），抗性水平明显高于长江流域棉区的绿盲蝽种群（刘佳等，2015）。
本课题组筛选的绿盲蝽抗性品系对毒死蜱的抗性达到200倍，且为多基因控制的偏显性遗传，表明其抗性除靶标突变外（Wu et al.,2015)可能有代谢因子的参与，细胞色素P450极有可能在绿盲蝽对毒死蜱的代谢和抗性形成过程中发挥巨大作用。本文通过转录组测序技术分析绿盲蝽毒死蜱抗性品系中细胞色素P450超基因家族的表达信息，同时以实时定量PCR方法验证P450基因的表达量，研究结果将明确多功能氧化酶基因表达水平与绿盲蝽毒死蜱代谢抗性的关系，并为绿盲蝽的化学防治、抗性治理提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 供试昆虫
绿盲蝽室内敏感品系(SLF)：2008年由中国农业科学院植物保护研究所河北廊坊基地提供，在室内人工饲养45代以上，期间未接触任何杀虫剂。
绿盲蝽敏感品系(BZS)：2009年7月采自山东省滨州市无棣县，在室内人工饲养30代以上，期间未接触任何杀虫剂。
绿盲蝽毒死蜱抗性品系(BZR)：由BZS品系在室内用毒死蜱筛选40代获得，每代保持50％的选择压力，至2017年3月对毒死蜱的抗性倍数达200倍。
饲养条件：温度为26±10℃，相对湿度为70％左右，光周期为15L：9D。成虫期饲喂四季豆。供产卵用的四季豆需要人为制造一些伤口，卵直接产于四季豆伤口处，之后收集孵化，若虫期饲喂新鲜玉米（陆宴辉等，2008）。
1．2 主要试剂和仪器
1．2．1 主要试剂
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试昆虫 2
1.2 主要试剂和仪器2
1.2.1 主要试剂2
1.2.2 主要仪器设备2
1.3 试验方法2
1.3.1 转录组测序2
1.3.2 转录组数据分析2
1.3.3 绿盲蝽总RNA的提取3
1.3.4 RNA质量检测3
1.3.5 定量反转录3
1.3.6 荧光实时定量PCR3
2 结果与分析4
2.1 P450基因转录组测序结果4
2.2 P450基因定量PCR产物熔解曲线和扩增效率一致性分析5
2.3 P450基因表达量的定量验证5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
图 1 定量PCR扩增效率5
图2 P450基因在不同绿盲蝽品系中的相对表达量6
表1 引物信息4
表2 绿盲蝽转录组解毒酶基因数据分析4
表3 绿盲蝽转录组P450基因 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
数据分析5
绿盲蝽毒死蜱抗性品系中P450基因相对表达量的变化
引言
与其他生物体相同，昆虫细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450，P450/CYP/CYP P450) 也是多功能氧化酶系（mixed function oxidases，MFO)的末端氧化酶，可与底物结合以及从还原型辅酶Ⅱ（NADPH）传递电子到细胞色素P450还原酶，在MFO系统的氧化代谢功能中起核心作用。昆虫细胞色素P450不仅参与内源活性物质（如固醇类激素、脂类等）的合成及代谢过程，同时在杀虫剂、植物毒素等外源化合物的代谢中也起着重要作用（Feyereisen，2012)。
细胞色素P450底物广谱，可代谢不同结构的杀虫剂，由P450介导的解毒代谢增强是昆虫对有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和烟碱类等多种类型的杀虫剂产生抗性的重要机制(Estabrook, 1996)。昆虫对有机磷杀虫剂代谢能力的增强及抗性产生与抗性昆虫中细胞色素P450基因的过量表达密切相关。家蝇（Musca domestica）二嗪磷抗性品系Rutgers中cyp6a1 mRNA水平至少为敏感品系的10倍(Carino et al.，1994)；黑腹果蝇抗性品系91R中cyp6a2的表达水平是敏感品系的2030倍，这也是导致该品系对DDT和马拉硫磷产生高水平抗性的主要原因(Waters et al.，1992)；灰飞虱中3种P450基因CYP6AY3v2、CYP306A2v2、CYP353D1v2的过量表达，导致了其对毒死蜱的代谢抗性(Xu et al., 2014)。
绿盲蝽（Apolygus lucorum）属于半翅目(Heteroptera)盲蝽科(Miridae)，其寄主含棉花等50余科200多种植物，主要为害我国黄河流域的大部分棉田，是一类重要的农业害虫(萧采瑜和孟祥玲，1963；Lu等，2008)。近些年来，我国在防治盲蝽的过程中由于杀虫剂的过度及不合理使用已导致其对杀虫剂的敏感性降低，引致抗药性问题。山东省聊城、滨州绿盲蝽种群对灭多威、硫丹和氟虫腈的敏感性下降（Guo et al.，2010；张小兵等，2013），河南新乡、安徽无为、山东滨州绿盲蝽种群对马拉硫磷、三氟氯氰菊酯和硫丹产生低水平抗性（谭瑶等，2012），2011至2014年间，黄河流域棉区的滨州及沧州种群对毒死蜱已产生中等水平抗性（1120倍），抗性水平明显高于长江流域棉区的绿盲蝽种群（刘佳等，2015）。
本课题组筛选的绿盲蝽抗性品系对毒死蜱的抗性达到200倍，且为多基因控制的偏显性遗传，表明其抗性除靶标突变外（Wu et al.,2015)可能有代谢因子的参与，细胞色素P450极有可能在绿盲蝽对毒死蜱的代谢和抗性形成过程中发挥巨大作用。本文通过转录组测序技术分析绿盲蝽毒死蜱抗性品系中细胞色素P450超基因家族的表达信息，同时以实时定量PCR方法验证P450基因的表达量，研究结果将明确多功能氧化酶基因表达水平与绿盲蝽毒死蜱代谢抗性的关系，并为绿盲蝽的化学防治、抗性治理提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 供试昆虫
绿盲蝽室内敏感品系(SLF)：2008年由中国农业科学院植物保护研究所河北廊坊基地提供，在室内人工饲养45代以上，期间未接触任何杀虫剂。
绿盲蝽敏感品系(BZS)：2009年7月采自山东省滨州市无棣县，在室内人工饲养30代以上，期间未接触任何杀虫剂。
绿盲蝽毒死蜱抗性品系(BZR)：由BZS品系在室内用毒死蜱筛选40代获得，每代保持50％的选择压力，至2017年3月对毒死蜱的抗性倍数达200倍。
饲养条件：温度为26±10℃，相对湿度为70％左右，光周期为15L：9D。成虫期饲喂四季豆。供产卵用的四季豆需要人为制造一些伤口，卵直接产于四季豆伤口处，之后收集孵化，若虫期饲喂新鲜玉米（陆宴辉等，2008）。
1．2 主要试剂和仪器
1．2．1 主要试剂
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