一个水稻脆杆突变体hsp表型分析及基因定位
：水稻（Oryza.Sativa L.）是世界上重要的粮食作物之一，茎秆机械强度是一种重要的农艺性状，主要通过影响作物的抗倒伏性来影响其产量。在植物中茎秆机械强度主要与细胞壁的特性有关，细胞壁结构和组成成分的改变都将影响到机械强度。植物的细胞壁是一个复杂的动态网络，有很多合成和调节的途径，目前依然不清楚。因此发现新的参与细胞壁合成的因子并深入的研究是非常重要的。另外，脆性的茎秆在微生物发酵、动物饲料生产上都较普通水稻表现优良，深入研究茎秆的脆性在农业生产中具有较高的应用价值。本研究用MNU诱变籼稻品种9311，从中分离和鉴定出一个脆杆突变体hsp（height stem particle）。该突变体表现为茎节变脆，植株高度降低，籽粒变小。利用hsp与籼稻品种N22和粳稻品种TC65的F2分离群体对目的基因进行连锁分析和精细定位，为研究该基因在细胞壁合成途径中的功能奠定基础。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言（或绪论）2
1□材料与方法 5
1.1□材料 5
1.2□方法 5
1.2.1□木质素染色 5
1.2.2□种子千粒重，粒长，粒宽和粒厚测定5
1.2.3□突变体的连锁分析与精细定位 5
2□结果与分析 7
2.1□表型分析 7
2.2□基因定位 8
3□讨论 11
致谢 12
参考文献 12
附录 13
一个水稻脆杆突变体hsp表型分析及基因定位
引言
引言
水稻（Oryza.Sativa L.）机械强度是一种重要的农艺性状，主要通过影响作物的抗倒伏来影响其产量。植物机械强度主要取决于植物细胞壁的特性，细胞壁结构或组成成分的改变将会影响到机械强度。细胞壁是一种主要由纤维素分子组成的纤维体系，纤维素是由β械强，4糖苷键连接起来的高分子聚合物[1]。初生壁中纤维素的含量约为2030%，而在次生壁中纤维素的含量可以达到4090%[2]。初生壁是原生质体在生长发育时分泌形成的一层较薄的细胞壁，主要由纤维素，半纤维素
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
和果胶质交联形成的网状结构。初生壁具有较大的可塑性，能随着细胞生长而扩张。而次生壁是细胞停止生长后在初生壁和质膜之间形成的，主要由纤维素，半纤维素和木质素或其它次生代谢物沉积形成的具有多层结构的细胞壁，通常较厚，使细胞壁具有较大的机械强度。
水稻脆杆突变体是一种经典的突变体，Nagao和Takahashi在1963发现第一个脆杆突变体bc1。到目前为止，至少发现了18个脆杆突变体，大量的水稻脆杆突变体的发现为揭示细胞壁的形成提供了宝贵的材料资源。其中有部分相关基因得到了克隆。这些基因分别分布在第１染色体（BC7和BC11）、第2染色体（BC3，BC5，BC14）、第3染色体（BC1）、第5 染色体（BC2，BC10）、第6染色体（BC4）、第７染色体（BC8）和第９染色体（BC6，BC12，BC13，BC15），如表1.
表1 已经报道的脆杆基因
基因
基因功能
参考文献
BC1
BC1编码一个COBRAlike GPI锚定蛋白，它既可以控制纤维素在细胞壁上的沉淀，又可以决定细胞的扩展方向。
Li et al., Plant cell, 2003, 15,
20202031
BC3/OsDRP2B
BC3?编码一个经典的驱动蛋白OsDRP2B，参与纤维素的合成，对次生细胞壁的形成是必需的。
Xiong et al, Plant Journal, 2010, 64(1): 5670
BC7/OsCesA4
OsCesA4是一个纤维素合酶催化亚基，参与纤维素的合成。OsCesA4突变后引起茎秆中纤维素的含量显著降低，茎秆变得脆而细、株高变矮。
Tannka et al., Plant Physiology, 2003, 133(1): 7383
BC10
BC10编码一个高尔基体定位的膜蛋白,具有糖基转移酶的功能，是水稻细胞壁生物合成所必需。
Zhou et al. Plant Journal,
2009,?57 (3): 446 – 462
BC12
BC12编码一个驱动蛋白，参与细胞周期过程和纤维素微纤维沉淀。
Li et al., Plant cell, 2011, 23
(2): 628640
BC14/OsNST1
BC14/OsNST1编码一个具有尿苷二磷酸 葡萄糖(UDPGlucose)转运活性的高尔基体的核糖转运子（NST），参与细胞壁多糖及糖蛋白合成。
Song et al., Plant Signaling Behavior,?2011,?6(8): 10971100?
BC11/OsCesA7
OsCesA4,OsCesA7, OsCesA9?是3?个不同的纤维素合酶催化亚基，可能形成一个纤维素合成复合体参与次生细胞壁合成。
Tanaka et al., Plant Physiology,?2003,?133(1): 7383
BC6/OsCesA9
OsCesA4,OsCesA7, OsCesA9?是3个不同的纤维素合酶催化亚基，可能形成一个纤维素合成复合体参与次生细胞壁合成。
Tanaka et al., Plant Physiology,?2003,?133(1): 7383
BC15/ OsCTL1
BC15编码一个膜相关的类几丁质酶蛋白。它是纤维素合成所必需的，它的突变导致了水稻植株中纤维素含量的降低以及机械强度的降低。
Wu et al., Plant Physiology, 2012,?159(4): 14401452?
以上表中基因信息来源于国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn/variety/
以上是目前为止已经克隆出的脆杆基因，就功能而言可以分为五类：（一）编码类COBRA 蛋白。COBRA 蛋白是一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI ），已有研究表明[3]，类COBRA 蛋白参与拟南芥的纤维素合成，控制植物细胞壁中纤维素含量及细胞定向伸长。BC1是第一个被克隆出的水稻脆杆基因，该基因编码一个COBRAlike GPI锚定蛋白，主要在维管束和厚壁组织中表达。通过增加木质素含量，降低纤维素含量来降低细胞壁的厚度，从而降低茎秆的机械强度。（二）编码动力相关蛋白。动力蛋白和动力相关蛋白(DRPs)是一类大的GTP 酶，作用于管状膜与囊泡膜，其在内吞作用、细胞分裂、细胞器生物合成以及后高尔基体跨膜转运过程中起着重要作用[4]。由于细胞壁形成过程中质膜和细胞质间的跨膜运输是影响多糖沉淀的重要过程，所以动力相关蛋白与细胞壁的合成也密切相关。如BC3和BC12。BC3 编码一个OsDRP2B，它是DRP2 经典膜动力蛋白家族的一员，同时位于质膜与网格蛋白介导的囊泡和反式高尔基网络(TGN)，很可能参与内吞途径以及后高尔基体跨膜转运。BC3 基因突变导致植株根、茎、叶中的纤维素含量降低28%36%，从而降低厚壁组织与实质细胞的细胞壁厚度，改变细胞壁结构，但不影响其他细胞壁成分，这与其他脆性突变体的生理特点大不相同。BC12基因编码kinesin4 驱动蛋白，该类蛋白在动物和植物细胞中除提供能量外还具有其他生理功能[5]。研究表明，BC12 主要在组织进行细胞分裂和次生细胞壁加厚过程中表达，其产物BC12 蛋白存在于细胞分裂过程中细胞核、细胞质以及微管等细胞器。细胞数目的显著减少和微管沉积方向与细胞壁组分的改变是造成BC12 突变体呈现矮杆表型的重要原因。（三）编码纤维素合酶。纤维素合酶(CESA)是纤维素合酶复合物响应葡萄聚糖链延伸的重要催化亚基。水稻中也发现了至少9 个CesA 基因，这些基因根据其参与初生细胞壁和次生细胞壁纤维素合成的不同被分为两类，其中有些在纤维素合酶复合物(CSC)形成过程中起着协同参与作用[6]。有研究表明[7]，内源性反转录转座子Tos17 插入引起3 个不同水稻脆性基因(OsCesA4, OsCesA7 和OsCesA9)的突变，这三个基因均与CesA 有关，而单个基因的突变均导致次生细胞壁纤维素含量显著降低，表明这些基因并非功能冗余。BC6，BC7，BC11分别编码CesA9，CesA4，CesA7，这些基因的发现为揭示单个CesA基因的功能提供了依据。（四） 编码糖基转移酶与核糖转运子。糖基转移酶(GT)是一系列参与催化双糖、多聚糖以及糖链合成的一类酶，负责将活性供体的单糖转移到糖、蛋白质、脂类和核酸分子上，完成糖基化反应，是植物细胞壁多聚糖和糖蛋白合成所必需的酶家族之一。BC10基因基因编码一个Ⅱ型内整合膜蛋白，位于具有DUF266 结构域的高尔基体。它的突变引起纤维素合成受损以及阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)水平的下降，从而导致植株机械强度的下降。研究表明[7] , BC10 是通过调节细胞壁纤维素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量来控制水稻植株的机械强度，影响植物的生长和发育。体外酶活实验则证实了BC10 具有糖基转移酶的功能，是水稻细胞壁生物合成所必需的。BC14/OsNST1基因，编码一个具有尿苷二磷酸 葡萄糖(UDPGlucose)转运活性的高尔基体的核糖转运子（NST），参与细胞壁多糖及糖蛋白合成。BC14/OsNST1 基因的错义突变引起纤维素含量下降，细胞壁结构改变，导致植株机械强度降低和生长发育缺陷[8]。这说明BC14/OsNST1 基因在细胞壁的合成与植物生长中具有多效性。此外，比较野生型与突变体的细胞壁糖分含量发现，BC14 突变体存在多糖糖基合成缺陷，说明BC14/OsNST1 提供葡萄糖亚基用于合成多糖基质，调控纤维素合成。（五）类几丁质酶。植物类几丁质酶就是一类糖苷水解酶，不仅参与植物正常生长和发育的多个过程，包括细胞壁代谢和抗病性等，同时也参与真菌、动物等生化和生理过程[9,10]。对水稻BC15 基因的研究，证实了位于高尔基体的几丁质酶类蛋白在水稻纤维素合成过程中起着重要作用[11]。类几丁质酶基因BC15/OsCTL1 在水稻的各个组织器官中广泛表达，其错义突变引起厚壁细胞细胞壁变薄和纤维素含量降低，造成茎秆机械强度严重下降，但水稻的正常生长发育未受到显著影响。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言（或绪论）2
1□材料与方法 5
1.1□材料 5
1.2□方法 5
1.2.1□木质素染色 5
1.2.2□种子千粒重，粒长，粒宽和粒厚测定5
1.2.3□突变体的连锁分析与精细定位 5
2□结果与分析 7
2.1□表型分析 7
2.2□基因定位 8
3□讨论 11
致谢 12
参考文献 12
附录 13
一个水稻脆杆突变体hsp表型分析及基因定位
引言
引言
水稻（Oryza.Sativa L.）机械强度是一种重要的农艺性状，主要通过影响作物的抗倒伏来影响其产量。植物机械强度主要取决于植物细胞壁的特性，细胞壁结构或组成成分的改变将会影响到机械强度。细胞壁是一种主要由纤维素分子组成的纤维体系，纤维素是由β械强，4糖苷键连接起来的高分子聚合物[1]。初生壁中纤维素的含量约为2030%，而在次生壁中纤维素的含量可以达到4090%[2]。初生壁是原生质体在生长发育时分泌形成的一层较薄的细胞壁，主要由纤维素，半纤维素
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
和果胶质交联形成的网状结构。初生壁具有较大的可塑性，能随着细胞生长而扩张。而次生壁是细胞停止生长后在初生壁和质膜之间形成的，主要由纤维素，半纤维素和木质素或其它次生代谢物沉积形成的具有多层结构的细胞壁，通常较厚，使细胞壁具有较大的机械强度。
水稻脆杆突变体是一种经典的突变体，Nagao和Takahashi在1963发现第一个脆杆突变体bc1。到目前为止，至少发现了18个脆杆突变体，大量的水稻脆杆突变体的发现为揭示细胞壁的形成提供了宝贵的材料资源。其中有部分相关基因得到了克隆。这些基因分别分布在第１染色体（BC7和BC11）、第2染色体（BC3，BC5，BC14）、第3染色体（BC1）、第5 染色体（BC2，BC10）、第6染色体（BC4）、第７染色体（BC8）和第９染色体（BC6，BC12，BC13，BC15），如表1.
表1 已经报道的脆杆基因
基因
基因功能
参考文献
BC1
BC1编码一个COBRAlike GPI锚定蛋白，它既可以控制纤维素在细胞壁上的沉淀，又可以决定细胞的扩展方向。
Li et al., Plant cell, 2003, 15,
20202031
BC3/OsDRP2B
BC3?编码一个经典的驱动蛋白OsDRP2B，参与纤维素的合成，对次生细胞壁的形成是必需的。
Xiong et al, Plant Journal, 2010, 64(1): 5670
BC7/OsCesA4
OsCesA4是一个纤维素合酶催化亚基，参与纤维素的合成。OsCesA4突变后引起茎秆中纤维素的含量显著降低，茎秆变得脆而细、株高变矮。
Tannka et al., Plant Physiology, 2003, 133(1): 7383
BC10
BC10编码一个高尔基体定位的膜蛋白,具有糖基转移酶的功能，是水稻细胞壁生物合成所必需。
Zhou et al. Plant Journal,
2009,?57 (3): 446 – 462
BC12
BC12编码一个驱动蛋白，参与细胞周期过程和纤维素微纤维沉淀。
Li et al., Plant cell, 2011, 23
(2): 628640
BC14/OsNST1
BC14/OsNST1编码一个具有尿苷二磷酸 葡萄糖(UDPGlucose)转运活性的高尔基体的核糖转运子（NST），参与细胞壁多糖及糖蛋白合成。
Song et al., Plant Signaling Behavior,?2011,?6(8): 10971100?
BC11/OsCesA7
OsCesA4,OsCesA7, OsCesA9?是3?个不同的纤维素合酶催化亚基，可能形成一个纤维素合成复合体参与次生细胞壁合成。
Tanaka et al., Plant Physiology,?2003,?133(1): 7383
BC6/OsCesA9
OsCesA4,OsCesA7, OsCesA9?是3个不同的纤维素合酶催化亚基，可能形成一个纤维素合成复合体参与次生细胞壁合成。
Tanaka et al., Plant Physiology,?2003,?133(1): 7383
BC15/ OsCTL1
BC15编码一个膜相关的类几丁质酶蛋白。它是纤维素合成所必需的，它的突变导致了水稻植株中纤维素含量的降低以及机械强度的降低。
Wu et al., Plant Physiology, 2012,?159(4): 14401452?
以上表中基因信息来源于国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn/variety/
以上是目前为止已经克隆出的脆杆基因，就功能而言可以分为五类：（一）编码类COBRA 蛋白。COBRA 蛋白是一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI ），已有研究表明[3]，类COBRA 蛋白参与拟南芥的纤维素合成，控制植物细胞壁中纤维素含量及细胞定向伸长。BC1是第一个被克隆出的水稻脆杆基因，该基因编码一个COBRAlike GPI锚定蛋白，主要在维管束和厚壁组织中表达。通过增加木质素含量，降低纤维素含量来降低细胞壁的厚度，从而降低茎秆的机械强度。（二）编码动力相关蛋白。动力蛋白和动力相关蛋白(DRPs)是一类大的GTP 酶，作用于管状膜与囊泡膜，其在内吞作用、细胞分裂、细胞器生物合成以及后高尔基体跨膜转运过程中起着重要作用[4]。由于细胞壁形成过程中质膜和细胞质间的跨膜运输是影响多糖沉淀的重要过程，所以动力相关蛋白与细胞壁的合成也密切相关。如BC3和BC12。BC3 编码一个OsDRP2B，它是DRP2 经典膜动力蛋白家族的一员，同时位于质膜与网格蛋白介导的囊泡和反式高尔基网络(TGN)，很可能参与内吞途径以及后高尔基体跨膜转运。BC3 基因突变导致植株根、茎、叶中的纤维素含量降低28%36%，从而降低厚壁组织与实质细胞的细胞壁厚度，改变细胞壁结构，但不影响其他细胞壁成分，这与其他脆性突变体的生理特点大不相同。BC12基因编码kinesin4 驱动蛋白，该类蛋白在动物和植物细胞中除提供能量外还具有其他生理功能[5]。研究表明，BC12 主要在组织进行细胞分裂和次生细胞壁加厚过程中表达，其产物BC12 蛋白存在于细胞分裂过程中细胞核、细胞质以及微管等细胞器。细胞数目的显著减少和微管沉积方向与细胞壁组分的改变是造成BC12 突变体呈现矮杆表型的重要原因。（三）编码纤维素合酶。纤维素合酶(CESA)是纤维素合酶复合物响应葡萄聚糖链延伸的重要催化亚基。水稻中也发现了至少9 个CesA 基因，这些基因根据其参与初生细胞壁和次生细胞壁纤维素合成的不同被分为两类，其中有些在纤维素合酶复合物(CSC)形成过程中起着协同参与作用[6]。有研究表明[7]，内源性反转录转座子Tos17 插入引起3 个不同水稻脆性基因(OsCesA4, OsCesA7 和OsCesA9)的突变，这三个基因均与CesA 有关，而单个基因的突变均导致次生细胞壁纤维素含量显著降低，表明这些基因并非功能冗余。BC6，BC7，BC11分别编码CesA9，CesA4，CesA7，这些基因的发现为揭示单个CesA基因的功能提供了依据。（四） 编码糖基转移酶与核糖转运子。糖基转移酶(GT)是一系列参与催化双糖、多聚糖以及糖链合成的一类酶，负责将活性供体的单糖转移到糖、蛋白质、脂类和核酸分子上，完成糖基化反应，是植物细胞壁多聚糖和糖蛋白合成所必需的酶家族之一。BC10基因基因编码一个Ⅱ型内整合膜蛋白，位于具有DUF266 结构域的高尔基体。它的突变引起纤维素合成受损以及阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)水平的下降，从而导致植株机械强度的下降。研究表明[7] , BC10 是通过调节细胞壁纤维素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量来控制水稻植株的机械强度，影响植物的生长和发育。体外酶活实验则证实了BC10 具有糖基转移酶的功能，是水稻细胞壁生物合成所必需的。BC14/OsNST1基因，编码一个具有尿苷二磷酸 葡萄糖(UDPGlucose)转运活性的高尔基体的核糖转运子（NST），参与细胞壁多糖及糖蛋白合成。BC14/OsNST1 基因的错义突变引起纤维素含量下降，细胞壁结构改变，导致植株机械强度降低和生长发育缺陷[8]。这说明BC14/OsNST1 基因在细胞壁的合成与植物生长中具有多效性。此外，比较野生型与突变体的细胞壁糖分含量发现，BC14 突变体存在多糖糖基合成缺陷，说明BC14/OsNST1 提供葡萄糖亚基用于合成多糖基质，调控纤维素合成。（五）类几丁质酶。植物类几丁质酶就是一类糖苷水解酶，不仅参与植物正常生长和发育的多个过程，包括细胞壁代谢和抗病性等，同时也参与真菌、动物等生化和生理过程[9,10]。对水稻BC15 基因的研究，证实了位于高尔基体的几丁质酶类蛋白在水稻纤维素合成过程中起着重要作用[11]。类几丁质酶基因BC15/OsCTL1 在水稻的各个组织器官中广泛表达，其错义突变引起厚壁细胞细胞壁变薄和纤维素含量降低，造成茎秆机械强度严重下降，但水稻的正常生长发育未受到显著影响。
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