番茄斑萎病毒核衣壳蛋白n所诱导的死亡与erstress相关性的研究
前期研究表明，番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）的核衣壳蛋白可在本氏烟中产生类似病毒侵染所导致的坏死症状。蛋白质在内质网（endoplasmic reticulum, ER）中合成。当蛋白质超过一定数值后，就会影响内质网的正常功能，从而引起内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress, ERS）。ERS会使细胞发生坏死。为研究TSWV的N蛋白诱导的细胞死亡是否与内质网胁迫有关。我们扩增本氏烟的BiP（NbBiP）基因，然后连接到表达载体p2300-3×HA，再用农杆菌浸润的方法瞬时表达NbBiP基因，看它对TSWV核衣壳蛋白N诱导的死亡的影响。结果发现表达NbBip对N诱导的死亡没有影响，说明ERS与N诱导的死亡无关。
目录
摘要 1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1方法2
1.1载体的构建 2
1.1.1提取RNA 2
1.1.2逆转录3
1.1.3片段扩增4
1.1.4割胶回收4
1.1.5酶切5
1.1.6酶切回收5
1.1.7片段与载体连接5
1.1.8转化DH5α5
1.1.9菌落PCR5
1.2载体的构建6
1.2.1质粒DNA的抽提6
1.2.2测序6
1.3转化农杆菌7
1.4western blot实验步骤7
2 结果与分析8
2.1载体的构建8
2.1.1片段扩增8
2.1.2筛选阳性克隆9
2.2农杆菌转化9
2.3western blot10
3 讨论10
3.1测序的重要性10
3.2实验的准确性10
致谢10
参考文献12
番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N所诱导的死亡与ERstress相关性的研究
引言
引言:布尼亚病毒科(Bunuyavirida *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
e)可以侵染植物，其中发现了1个病毒—番茄斑萎病毒 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) [1]。人们发现了大丽菊之后，接着又从椒类和许多其他可观看植物中分离出了该病毒。从1990后番茄斑萎病毒在世界上很多地方传播，它一跃而成为了对蔬菜侵袭非常严重的病原之一[2]。通常由蓟马散布传播的番茄斑萎病毒是Tospovirus 属，它拥有大量的寄主，能感染80多个科800多种植物[3],，其中包括100多种发生感病状态的单子叶植物以及双子叶植物，更有300多种植物可以发生汁水传播。菊科和茄科以及葫芦科等相似的植物都会被剧烈的影响。他的寄主植物在我们生活中也很常见，像花生和辣椒等。番茄斑萎病毒同样也可以让一些杂草染病，比如蒲公英等。烟草和番茄这样的植物一般是系统侵染；黄瓜和喇叭花等一般都为局部侵染[4]。这种病毒可能引起十分惨重的经济下滑，尤其是在蔬菜和花卉上，所以它被国际植物病理学界严格对待我们也并不会觉得奇怪[5]。番茄斑萎病毒的为害症状会有非常大的不同，就算它发生在一种寄主植物上，也会由于年龄、温湿度的不同而不一样。该病毒很大程度上在烟草的新鲜叶片上会引发斑点这样的症状，甚至有一些竟然可以在叶片边缘出现小的坏死圈，然后慢慢的扩大，不规则的坏死圈就这样形成了。其他的坏死病毒病和这种病毒的有很大的不同:烟草上的病毒呈现不对称的生长，病株十分矮小，顶端还会下垂，叶片也会生长的很奇怪。受到危害十分严重的时候，叶片会一点点下垂，然后趋于死亡。叶片感染病毒了之后会出现异样的症状，不具有任何烘烤价值[6]。TSWV编码的核衣壳蛋白N是病毒最重要的结构蛋白，在病毒侵染循环中发挥多种功能：1、参与病毒的组装：N包含多个RNA结合位点并可通过首尾结合的方式形成多聚体从而识别与包装病毒的基因组RNA，N还能和糖蛋白Gn/Gc互作促进病毒粒体的包壳。2、参与病毒RNA的合成：N可通过调控RNA转录和复制的转换在病毒RNA合成的早期发挥重要作用。3、参与病毒的移动：N能与移动蛋白NSm互作，还能促进TMV的长距离移动[7]，说明它与病毒的移动有关。4、是病毒的无毒因子：N能在一种抗性辣椒（Capsicum chinese）上诱导产生细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），说明它可能是病毒的无毒因子。陶小荣课题组的研究发现N可在内质网和肌动蛋白的网络中高速运动，这是对植物病毒外壳蛋白胞内运动功能的首次报道[8]；此外，Li等利用同源建模的方式发现了N的另一种功能，即将病毒RNA包埋于由其N端和C端结构域构成的深沟中，从而保护病毒基因组不被降解[9]。蛋白质的合成大多在内质网（endoplasmic reticulum，ER）。在大多数情况下，蛋白质的错误排布会因为在内质网中聚集的细胞中蛋白质异常所引起。当蛋白质超过一定数值后，就会影响到内质网的正常功能，从而引起内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress, ERS）[10]。要想保持细胞中一些正常的功能，内质网一般情况下会激活未折叠蛋白应答（unfolded protein response，UPR）。当内质网胁迫发生的时间很长了之后，没有办法及时复原的内环境，会产生严重的后果。植物在一类特殊的条件下会诱导 ERS，在缓解胁迫过程中UPR起到了不可回避的作用，说明了ERS和UPR之间存在着必要的关联[11]。近些年来因为内质网胁迫从而引起的细胞死亡不断发生。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是细胞中作用很明显的一部分，与蛋白质有着很大的联系，也是胆固醇合成的场所。内质网通过启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）[12]保护由ERS所引起的细胞损伤，恢复细胞功能。内质网中的没有折叠的蛋白质会一点点在一些帮助下慢慢折叠起来，细胞也会因为这种情况的出现存活下去。倘若受到十分严重的伤害，我们就另当别论了。内质网的这些自我修复功能可以让受到损坏的细胞逐渐恢复，也可以彻底清除一些坏死的细胞，让任何机体的内环境可以正常运转[13]。
1 方法
1．1 载体的构建
1．1．1提取RNA
预防RNase污染，应该注意以下方面：
形成佩带新手套的习惯。因为人身体常有细菌，可能导致RNase的污染；
使用没有RNase的塑料制品和枪头避免甲叉污染；
RNA在Trizol试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中不应该使用不含有RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可以在150℃烘烤4h，塑料器皿可以在0.5M氢氧化钠溶液中浸泡10min，然后用清水彻底清洗，在灭菌，随即可以除去RNase；
配制溶液应该使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），放置过夜，高温灭菌）。
Trizol提取法
准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均需用DEPC处理的水配置）。
操作步骤
匀浆处理：
a组织：在液氮中将其磨碎，1ml Trizol中含有50mg左右的组织，进行的匀浆处理我们需要使用特定仪器。样品的体积不能够超过Trizol体积的10%；
b单层细胞培养：Trizol裂解之后的细胞加到平板中，大约10cm2面积加1ml，然后用枪头吸打多次。需要多少Trizol应该根据平板的面积，与细胞数量没有直接的关系。Trizol用量过少有可能会发生提取的RNA中存在一些DNA；
目录
摘要 1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1方法2
1.1载体的构建 2
1.1.1提取RNA 2
1.1.2逆转录3
1.1.3片段扩增4
1.1.4割胶回收4
1.1.5酶切5
1.1.6酶切回收5
1.1.7片段与载体连接5
1.1.8转化DH5α5
1.1.9菌落PCR5
1.2载体的构建6
1.2.1质粒DNA的抽提6
1.2.2测序6
1.3转化农杆菌7
1.4western blot实验步骤7
2 结果与分析8
2.1载体的构建8
2.1.1片段扩增8
2.1.2筛选阳性克隆9
2.2农杆菌转化9
2.3western blot10
3 讨论10
3.1测序的重要性10
3.2实验的准确性10
致谢10
参考文献12
番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N所诱导的死亡与ERstress相关性的研究
引言
引言:布尼亚病毒科(Bunuyavirida *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
e)可以侵染植物，其中发现了1个病毒—番茄斑萎病毒 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) [1]。人们发现了大丽菊之后，接着又从椒类和许多其他可观看植物中分离出了该病毒。从1990后番茄斑萎病毒在世界上很多地方传播，它一跃而成为了对蔬菜侵袭非常严重的病原之一[2]。通常由蓟马散布传播的番茄斑萎病毒是Tospovirus 属，它拥有大量的寄主，能感染80多个科800多种植物[3],，其中包括100多种发生感病状态的单子叶植物以及双子叶植物，更有300多种植物可以发生汁水传播。菊科和茄科以及葫芦科等相似的植物都会被剧烈的影响。他的寄主植物在我们生活中也很常见，像花生和辣椒等。番茄斑萎病毒同样也可以让一些杂草染病，比如蒲公英等。烟草和番茄这样的植物一般是系统侵染；黄瓜和喇叭花等一般都为局部侵染[4]。这种病毒可能引起十分惨重的经济下滑，尤其是在蔬菜和花卉上，所以它被国际植物病理学界严格对待我们也并不会觉得奇怪[5]。番茄斑萎病毒的为害症状会有非常大的不同，就算它发生在一种寄主植物上，也会由于年龄、温湿度的不同而不一样。该病毒很大程度上在烟草的新鲜叶片上会引发斑点这样的症状，甚至有一些竟然可以在叶片边缘出现小的坏死圈，然后慢慢的扩大，不规则的坏死圈就这样形成了。其他的坏死病毒病和这种病毒的有很大的不同:烟草上的病毒呈现不对称的生长，病株十分矮小，顶端还会下垂，叶片也会生长的很奇怪。受到危害十分严重的时候，叶片会一点点下垂，然后趋于死亡。叶片感染病毒了之后会出现异样的症状，不具有任何烘烤价值[6]。TSWV编码的核衣壳蛋白N是病毒最重要的结构蛋白，在病毒侵染循环中发挥多种功能：1、参与病毒的组装：N包含多个RNA结合位点并可通过首尾结合的方式形成多聚体从而识别与包装病毒的基因组RNA，N还能和糖蛋白Gn/Gc互作促进病毒粒体的包壳。2、参与病毒RNA的合成：N可通过调控RNA转录和复制的转换在病毒RNA合成的早期发挥重要作用。3、参与病毒的移动：N能与移动蛋白NSm互作，还能促进TMV的长距离移动[7]，说明它与病毒的移动有关。4、是病毒的无毒因子：N能在一种抗性辣椒（Capsicum chinese）上诱导产生细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），说明它可能是病毒的无毒因子。陶小荣课题组的研究发现N可在内质网和肌动蛋白的网络中高速运动，这是对植物病毒外壳蛋白胞内运动功能的首次报道[8]；此外，Li等利用同源建模的方式发现了N的另一种功能，即将病毒RNA包埋于由其N端和C端结构域构成的深沟中，从而保护病毒基因组不被降解[9]。蛋白质的合成大多在内质网（endoplasmic reticulum，ER）。在大多数情况下，蛋白质的错误排布会因为在内质网中聚集的细胞中蛋白质异常所引起。当蛋白质超过一定数值后，就会影响到内质网的正常功能，从而引起内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress, ERS）[10]。要想保持细胞中一些正常的功能，内质网一般情况下会激活未折叠蛋白应答（unfolded protein response，UPR）。当内质网胁迫发生的时间很长了之后，没有办法及时复原的内环境，会产生严重的后果。植物在一类特殊的条件下会诱导 ERS，在缓解胁迫过程中UPR起到了不可回避的作用，说明了ERS和UPR之间存在着必要的关联[11]。近些年来因为内质网胁迫从而引起的细胞死亡不断发生。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是细胞中作用很明显的一部分，与蛋白质有着很大的联系，也是胆固醇合成的场所。内质网通过启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）[12]保护由ERS所引起的细胞损伤，恢复细胞功能。内质网中的没有折叠的蛋白质会一点点在一些帮助下慢慢折叠起来，细胞也会因为这种情况的出现存活下去。倘若受到十分严重的伤害，我们就另当别论了。内质网的这些自我修复功能可以让受到损坏的细胞逐渐恢复，也可以彻底清除一些坏死的细胞，让任何机体的内环境可以正常运转[13]。
1 方法
1．1 载体的构建
1．1．1提取RNA
预防RNase污染，应该注意以下方面：
形成佩带新手套的习惯。因为人身体常有细菌，可能导致RNase的污染；
使用没有RNase的塑料制品和枪头避免甲叉污染；
RNA在Trizol试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中不应该使用不含有RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可以在150℃烘烤4h，塑料器皿可以在0.5M氢氧化钠溶液中浸泡10min，然后用清水彻底清洗，在灭菌，随即可以除去RNase；
配制溶液应该使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），放置过夜，高温灭菌）。
Trizol提取法
准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均需用DEPC处理的水配置）。
操作步骤
匀浆处理：
a组织：在液氮中将其磨碎，1ml Trizol中含有50mg左右的组织，进行的匀浆处理我们需要使用特定仪器。样品的体积不能够超过Trizol体积的10%；
b单层细胞培养：Trizol裂解之后的细胞加到平板中，大约10cm2面积加1ml，然后用枪头吸打多次。需要多少Trizol应该根据平板的面积，与细胞数量没有直接的关系。Trizol用量过少有可能会发生提取的RNA中存在一些DNA；
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