梨炭疽菌遗传转化体系的初步建立
摘要：由胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的梨炭疽病是梨树上的重要病害之一，给我国农业生产造成严重的经济损失。本研究以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，采用PEG介导转化法将外源质粒pYF11-GFP DNA转化到胶孢炭疽病菌的原生质体中。结果表明，菌丝在9mg/ml的裂解酶液作用下，酶解1.5 h可以获得108/ml的原生质体；通过含有博莱霉素浓度为400 μg/ml的PSA选择培养基筛选转化子，每μg DNA平均转化效率可达到35个转化子。对转化子进行PCR鉴定，表明GFP基因已经成功整合到梨炭疽病菌的基因组中，通过荧光显微观察发现转化子能够发出强的绿色荧光。成功建立胶孢炭疽菌的遗传转化体系为从分子水平上研究胶孢炭疽病菌的基因功能及致病机理奠定基础。
目录
摘要2
关键词...2
Abstract....2
Key words.2引言（或绪论）3
1材料与方法....3
1.1材料 ...3
1.1.1.菌株及质粒......3
1.1.2培养基..3
1.1.3试剂..3
1.2方法 ....4
1.2.1梨炭疽病菌的单孢分离..4
1.2.2 病原菌DNA提取...4
1.2.3 ITS序列分析............4
1.2.4生长状况......5
1.2.5产孢情况......5
1.2.6致病性测定......5
1.2.7梨炭疽病菌对博来霉素的敏感性测定...........................5
1.2.8质粒提取.......................................................................................................5
1.2.9 DNA凝胶回收....................................................................................
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
.........6
1.2.10 trans连接....................................................................................................6
1.2.11梨炭疽病菌原生质体的制备.....................................................................6
1.2.12 梨炭疽病菌的转化...................................................................................7
1.2.13 梨炭疽病菌转化子的PCR鉴定..............................................................7
1.2.14梨炭疽病菌转化子GFP荧光的观察.......................................................7
2.结果及分析........................................................................................................7
2.1 ITS序列分析..................................................................................................7
2.2菌株的表型测定.............................................................................................8
2.3菌株II17的表型测定...................................................................................8
2.4博来霉素的敏感性测定.................................................................................9
2.5原生质体的转化...........................................................................................10
2.6 转化子PCR鉴定及GFP荧光显微观察...................................................10
3讨论..................11
致谢........12
参考文献........13
梨炭疽菌遗传转化体系的初步建立
植保111 12111101 马靖宇
引言
引言
胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的梨炭疽病（Pear anthracnose），亦称苦腐病、晚腐病，是梨树上的重要病害之一。近几年来，该病在黄河故道梨产区普遍发生，尤其砀山梨危害明显，病害流行年份病果达到70%以上[1]。梨炭疽病菌主要为害果实，也能侵染叶片和枝干等。果实初发病时果面上产生黑色斑点，随着病斑逐步扩大，病斑表面颜色深浅交错，具明显同心轮纹。病斑中心生出无数略隆起的小粒点，初褐色，后变黑色，此即病菌的分生孢子盘。在温暖潮湿时，分生孢子盘生出一层粉红色的砧质物，此为分生孢子团块。叶片上发病初期在叶片正面形成褐色近圆形的小病斑，之后逐渐变成炭白色，常有同心轮纹。梨炭疽病多发生在生长衰弱或组织不充实的枝干，初期形成深褐色的小斑点，逐渐发展成长为椭圆形或长条形的病斑，病斑中部干缩凹陷，最终导致枝干枯死[2,3,4]。
梨炭疽病病原无性世代为半知菌亚门刺盘孢属的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），其有性世代是围小丛壳（Glomerella cingulata Stonem），属子囊菌亚门，球壳目，小从壳属，自然条件下较为罕见。胶孢炭疽菌通常以菌丝体和分生孢子在植物发病的部位进行越冬，条件合适时，分生孢子可以通过风雨、昆虫进行传播，落在寄主组织表面；孢子萌发形成芽管和附着胞，可以直接或者通过气孔、伤口侵入，从而导致植物发病。梨炭疽病菌的侵染策略为半活体营养型，其侵入机制十分复杂[5]。目前，国内外对炭疽病菌的研究主要集中在生物学特性、遗传多样性、化学药剂筛选等方面[3,4,1322]，而关于其致病相关基因报道较少，这在一定程度上限制了对其侵染过程和致病机制的深入认识，从而限制了防治该病技术的发展。因此，对胶孢炭疽菌进行以分子生物学为手段的功能基因组学研究，有助于更好地了解寄主病原物互作的相关机制[68]。
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摘要2
关键词...2
Abstract....2
Key words.2引言（或绪论）3
1材料与方法....3
1.1材料 ...3
1.1.1.菌株及质粒......3
1.1.2培养基..3
1.1.3试剂..3
1.2方法 ....4
1.2.1梨炭疽病菌的单孢分离..4
1.2.2 病原菌DNA提取...4
1.2.3 ITS序列分析............4
1.2.4生长状况......5
1.2.5产孢情况......5
1.2.6致病性测定......5
1.2.7梨炭疽病菌对博来霉素的敏感性测定...........................5
1.2.8质粒提取.......................................................................................................5
1.2.9 DNA凝胶回收....................................................................................
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.........6
1.2.10 trans连接....................................................................................................6
1.2.11梨炭疽病菌原生质体的制备.....................................................................6
1.2.12 梨炭疽病菌的转化...................................................................................7
1.2.13 梨炭疽病菌转化子的PCR鉴定..............................................................7
1.2.14梨炭疽病菌转化子GFP荧光的观察.......................................................7
2.结果及分析........................................................................................................7
2.1 ITS序列分析..................................................................................................7
2.2菌株的表型测定.............................................................................................8
2.3菌株II17的表型测定...................................................................................8
2.4博来霉素的敏感性测定.................................................................................9
2.5原生质体的转化...........................................................................................10
2.6 转化子PCR鉴定及GFP荧光显微观察...................................................10
3讨论..................11
致谢........12
参考文献........13
梨炭疽菌遗传转化体系的初步建立
植保111 12111101 马靖宇
引言
引言
胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的梨炭疽病（Pear anthracnose），亦称苦腐病、晚腐病，是梨树上的重要病害之一。近几年来，该病在黄河故道梨产区普遍发生，尤其砀山梨危害明显，病害流行年份病果达到70%以上[1]。梨炭疽病菌主要为害果实，也能侵染叶片和枝干等。果实初发病时果面上产生黑色斑点，随着病斑逐步扩大，病斑表面颜色深浅交错，具明显同心轮纹。病斑中心生出无数略隆起的小粒点，初褐色，后变黑色，此即病菌的分生孢子盘。在温暖潮湿时，分生孢子盘生出一层粉红色的砧质物，此为分生孢子团块。叶片上发病初期在叶片正面形成褐色近圆形的小病斑，之后逐渐变成炭白色，常有同心轮纹。梨炭疽病多发生在生长衰弱或组织不充实的枝干，初期形成深褐色的小斑点，逐渐发展成长为椭圆形或长条形的病斑，病斑中部干缩凹陷，最终导致枝干枯死[2,3,4]。
梨炭疽病病原无性世代为半知菌亚门刺盘孢属的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），其有性世代是围小丛壳（Glomerella cingulata Stonem），属子囊菌亚门，球壳目，小从壳属，自然条件下较为罕见。胶孢炭疽菌通常以菌丝体和分生孢子在植物发病的部位进行越冬，条件合适时，分生孢子可以通过风雨、昆虫进行传播，落在寄主组织表面；孢子萌发形成芽管和附着胞，可以直接或者通过气孔、伤口侵入，从而导致植物发病。梨炭疽病菌的侵染策略为半活体营养型，其侵入机制十分复杂[5]。目前，国内外对炭疽病菌的研究主要集中在生物学特性、遗传多样性、化学药剂筛选等方面[3,4,1322]，而关于其致病相关基因报道较少，这在一定程度上限制了对其侵染过程和致病机制的深入认识，从而限制了防治该病技术的发展。因此，对胶孢炭疽菌进行以分子生物学为手段的功能基因组学研究，有助于更好地了解寄主病原物互作的相关机制[68]。
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