水稻黄叶突变体chl16基因的初定位
：水稻是最重要的粮食作物之一。目前已完成了基因组测序，且其具有较小的基因组、成熟的遗传转化体系以及与其他禾谷类作物共线性等特点，因此成为单子叶植物研究的模式作物[1]。水稻叶色发生突变会直接影响植株的光合作用，从而影响有机物质的合成和积累，进而影响水稻的产量。叶片是水稻进行光合作用的主要器官，在水稻生长发育过程中起着重要的作用。因此，通过探明水稻叶色调控基因的遗传机制及分子调控机理，并应用于育种实践，是实现水稻产量再次飞跃的有效途径。叶色突变体是自然界常见的突变类型，以其性状明显，易于区分辨认的特点,很早就被人们关注。叶绿素是植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶绿素的生物合成经历了一个相当复杂的过程。当调控叶绿素代谢的相关基因发生突变时，植物的叶色就会发生变化。在水稻中已经发现了很多叶色突变体，根据表型可分为白化，黄化，浅绿，白翠，绿白，绿黄、黄绿和条纹等8种类型[2]，其不仅是研究高等植物光合作用、叶绿素合成、叶绿体分化与发育等重要材料，而且可作为标记性状用于杂交水稻的制种和繁殖。本研究从9311材料中中发现一份黄化突变体chl16对其形态特征、农艺性状、生理特性及叶绿体超微结构进行了研究，利用该黄化突变体与正常绿色粳稻品种宁粳4号杂交的Fp F2代分析了该黄化性状的遗传行为，并利用分子标记对该黄化突变基因进行了初定位。
目录
1 文献综述 5
1.1水稻叶色突变体的来源与分类 5
1.1.1叶色突变体的来源 5
1.1.2叶色突变体的分类 6
1.2叶色突变体的研究进展 6
1.2.1叶色相关突变发生的分子机理 6
1.2.2水稻叶色突变体的遗传方式 7
1.2.3水稻叶色突变体的基因定位及克隆 8
1.3叶色突变体的应用价值 8
1.3.1叶色突变体在植物生理学和基因组学研究方面的应用 8
1.3.2叶色突变体可能作为一种优良的种质资源 8
1.3.3叶色突变体是观赏植物新品种培育的重要来源 8
1.3.4叶色突变体基因导入不育系能简化种子纯度鉴定程序 8
2 材料与方法 9
2.1 实验材料 9
2.1.1突变体chl16群体
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
的获得 9
2.1.2定位群体的构建 9
2.2 实验方法 9
2.2.1水稻黄化突变体的分离 9
2.2.2水稻黄化突变体突变基因的遗传 9
2.2.3水稻黄化突变体chl16的温敏性鉴定 9
2.2.6突变体和野生型植株在不同温度下各色素含量的测定 9
2.2.6 DNA的提取和扩增 9
2.2.7基因的初定位 11
3 实验结果与分析 11
3.1 水稻黄化突变体chl16的表型特征 12
3.2 水稻黄化突变体chl16的温敏性 12
3.3 水稻黄化突变体chl16在不同温度下的色素含量 12
3.4 水稻黄化突变体chl16突变基因的初定位 13
4 结果与讨论 14
4.1水稻黄化突变体chl16的突变类型和遗传特征 15
4.2水稻黄化突变体在育种工作中应用 15
水稻黄叶突变体chl16基因的初定位
引言
1 文献综述
1.1水稻叶色突变体的来源与分类
1.1.1叶色突变体的来源
1.1.1.1自发突变
自发突变（spontaneous mutation）即生物体在自然条件下产生的突变，不经过任何复杂的人工生物技术操作手段处理。此种突变变异类型丰富，可直接用于常规育种，不存在转基因安全性问题[3]。但自发叶色突变的频率极低，即便是获得了不错的突变体，也需要通过繁琐的位图克隆法分离自发突变基因，时间长、难度大，极大限制了自发叶色突变在功能基因组学中的研究利用[4]。
1.1.1.2人工诱变
1.1.1.2.1物理诱变
主要指通过对生物体进行辐射诱导的方式产生突变，从而获得可以稳定遗传的突变体。常用的物理诱变剂主要有紫外线，X—射线，γ射线，快中子，激光，微波，离子束等。对水稻进行物理诱变时，一般以处理干种子为主，也可处理幼穗分化植株。陈善福等用Coγ射线直接辐射龙特甫B干种子，诱发获得了白化、黄化和条纹等多种类型的叶色突变体[5]。
1.1.1.2.2化学诱变
化学诱变是指用化学诱变剂处理植物材料，以又发生物体发生可以稳定遗传的突变。化学诱变剂主要有：（1）烷化剂（包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等），对核酸进行烷化作用，导致DNA断裂、缺失或修补；（2）天然碱基类似物，主要与DNA碱基具有类似的结构，可以作为DNA的成分渗入到DNA分子中去，在DNA复制过程中导致错误配对，从而致使基因发生变异。此外，还有一些其他类型的化学诱变剂，如：氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等。
人工诱变虽能在短时间内获得大量突变体，但是产生的突变方向无法预知，需要处理大量材料才能筛选出理想的突变体材料[6]。而且，诱发突变很容易引起染色体片段的缺失、倒位、易位等，同时产生多个突变位点，从而难以分离出单个基因突变及其后续的基因功能组学研究。
1.1.1.3插入突变
插入突变（insertion mutagensis）即指将已知的、遗传分析清楚的DNA片段引入到基因组内部，致使某个基因的结构发生改变，往往使多出一段序列，从而得到可以稳定遗传的突变[7]。之后，再用反向PCR等分子生物学方法获得插入片段两端的序列片段，以得知突变基因的位点。插入突变最大的好处在于，可将插入元件作为标签，从基因组中直接找出相应的基因。但值得注意的是，插入突变以转基因技术为基础，涉及到转基因安全性问题，在将插入叶色突变体应用于农业生产之前，必须对其环境安全性和食用安全性进行深入的研究分析。
1.1.2叶色突变体的分类
1.1.2.1苗期叶色分类法
叶色突变常在苗期表达，且易于识别，因此苗期叶色一直是最为常用的叶色突变体分类标准[8]。然而苗期叶色分类法以表型性状为基础，具有一定的局限性。植物的表型性状与内部的遗传物质之间的关系并非一一对应。同一叶色突变性状可能受不同基因控制；同一基因发生突变，由于基因功能缺损的程度不同，可能造成不同表现型。番茄黄叶突变体au和yg2的表型性状极为相似，而研究表明在这两个突变体中分别发生了血红素加氧酶(heme oxygenase)和光敏色素生色团合酶(PFB synthase)基因突变[9]。Kumar和Soll将HEMA基因(编码谷氨酰tRNA 还原酶)的反义RNA 转入拟南芥后，转基因植株间即存在明显的叶色差异，并且叶色变异程度与HEMA 基因的表达水平成反比[10]。由此可见，简单以叶色为标准对突变体进行划分，很可能不利于研究基因的生物功能。但由于还未找到更为合理的分类方法，所以目前仍然根据苗期叶色划分叶色突变体。
1.1.2.2 其它分类法
对于突变性状在苗期之后表达的叶色突变体，必须采取其它分类方法。如常绿(stay green)突变体是常见的苗期后叶色变异体，在拟南芥[11]、菊花[12]、羊茅[13](Festuca pratensis) 等很多物种中都有发现，其最明显的特征是生育末期叶片保绿时间较长甚至完全不黄化。常绿突变以外的苗期后叶色变异比较少见，通常根据突变发生时的叶色对突变体进行归类，这一类突变体中研究比较透彻的是来自于小麦矮变一号的返白突变体[14]。
1.1.2.3现有叶色突变分类
大多数水稻叶色突变体的显著特征是叶片表现为不正常的颜色，多数在苗期表达，出现诸如白化、黄化、浅绿、条纹、斑点等叶色表型，其中白化、黄化的叶色突变体出现最多。据不完全统计，目前水稻中已发现77个相关的叶色突变体，其中包括白化12个,黄化16个，条纹n个，转绿型14个，斑点14个等5大类型。
目录
1 文献综述 5
1.1水稻叶色突变体的来源与分类 5
1.1.1叶色突变体的来源 5
1.1.2叶色突变体的分类 6
1.2叶色突变体的研究进展 6
1.2.1叶色相关突变发生的分子机理 6
1.2.2水稻叶色突变体的遗传方式 7
1.2.3水稻叶色突变体的基因定位及克隆 8
1.3叶色突变体的应用价值 8
1.3.1叶色突变体在植物生理学和基因组学研究方面的应用 8
1.3.2叶色突变体可能作为一种优良的种质资源 8
1.3.3叶色突变体是观赏植物新品种培育的重要来源 8
1.3.4叶色突变体基因导入不育系能简化种子纯度鉴定程序 8
2 材料与方法 9
2.1 实验材料 9
2.1.1突变体chl16群体
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
的获得 9
2.1.2定位群体的构建 9
2.2 实验方法 9
2.2.1水稻黄化突变体的分离 9
2.2.2水稻黄化突变体突变基因的遗传 9
2.2.3水稻黄化突变体chl16的温敏性鉴定 9
2.2.6突变体和野生型植株在不同温度下各色素含量的测定 9
2.2.6 DNA的提取和扩增 9
2.2.7基因的初定位 11
3 实验结果与分析 11
3.1 水稻黄化突变体chl16的表型特征 12
3.2 水稻黄化突变体chl16的温敏性 12
3.3 水稻黄化突变体chl16在不同温度下的色素含量 12
3.4 水稻黄化突变体chl16突变基因的初定位 13
4 结果与讨论 14
4.1水稻黄化突变体chl16的突变类型和遗传特征 15
4.2水稻黄化突变体在育种工作中应用 15
水稻黄叶突变体chl16基因的初定位
引言
1 文献综述
1.1水稻叶色突变体的来源与分类
1.1.1叶色突变体的来源
1.1.1.1自发突变
自发突变（spontaneous mutation）即生物体在自然条件下产生的突变，不经过任何复杂的人工生物技术操作手段处理。此种突变变异类型丰富，可直接用于常规育种，不存在转基因安全性问题[3]。但自发叶色突变的频率极低，即便是获得了不错的突变体，也需要通过繁琐的位图克隆法分离自发突变基因，时间长、难度大，极大限制了自发叶色突变在功能基因组学中的研究利用[4]。
1.1.1.2人工诱变
1.1.1.2.1物理诱变
主要指通过对生物体进行辐射诱导的方式产生突变，从而获得可以稳定遗传的突变体。常用的物理诱变剂主要有紫外线，X—射线，γ射线，快中子，激光，微波，离子束等。对水稻进行物理诱变时，一般以处理干种子为主，也可处理幼穗分化植株。陈善福等用Coγ射线直接辐射龙特甫B干种子，诱发获得了白化、黄化和条纹等多种类型的叶色突变体[5]。
1.1.1.2.2化学诱变
化学诱变是指用化学诱变剂处理植物材料，以又发生物体发生可以稳定遗传的突变。化学诱变剂主要有：（1）烷化剂（包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等），对核酸进行烷化作用，导致DNA断裂、缺失或修补；（2）天然碱基类似物，主要与DNA碱基具有类似的结构，可以作为DNA的成分渗入到DNA分子中去，在DNA复制过程中导致错误配对，从而致使基因发生变异。此外，还有一些其他类型的化学诱变剂，如：氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等。
人工诱变虽能在短时间内获得大量突变体，但是产生的突变方向无法预知，需要处理大量材料才能筛选出理想的突变体材料[6]。而且，诱发突变很容易引起染色体片段的缺失、倒位、易位等，同时产生多个突变位点，从而难以分离出单个基因突变及其后续的基因功能组学研究。
1.1.1.3插入突变
插入突变（insertion mutagensis）即指将已知的、遗传分析清楚的DNA片段引入到基因组内部，致使某个基因的结构发生改变，往往使多出一段序列，从而得到可以稳定遗传的突变[7]。之后，再用反向PCR等分子生物学方法获得插入片段两端的序列片段，以得知突变基因的位点。插入突变最大的好处在于，可将插入元件作为标签，从基因组中直接找出相应的基因。但值得注意的是，插入突变以转基因技术为基础，涉及到转基因安全性问题，在将插入叶色突变体应用于农业生产之前，必须对其环境安全性和食用安全性进行深入的研究分析。
1.1.2叶色突变体的分类
1.1.2.1苗期叶色分类法
叶色突变常在苗期表达，且易于识别，因此苗期叶色一直是最为常用的叶色突变体分类标准[8]。然而苗期叶色分类法以表型性状为基础，具有一定的局限性。植物的表型性状与内部的遗传物质之间的关系并非一一对应。同一叶色突变性状可能受不同基因控制；同一基因发生突变，由于基因功能缺损的程度不同，可能造成不同表现型。番茄黄叶突变体au和yg2的表型性状极为相似，而研究表明在这两个突变体中分别发生了血红素加氧酶(heme oxygenase)和光敏色素生色团合酶(PFB synthase)基因突变[9]。Kumar和Soll将HEMA基因(编码谷氨酰tRNA 还原酶)的反义RNA 转入拟南芥后，转基因植株间即存在明显的叶色差异，并且叶色变异程度与HEMA 基因的表达水平成反比[10]。由此可见，简单以叶色为标准对突变体进行划分，很可能不利于研究基因的生物功能。但由于还未找到更为合理的分类方法，所以目前仍然根据苗期叶色划分叶色突变体。
1.1.2.2 其它分类法
对于突变性状在苗期之后表达的叶色突变体，必须采取其它分类方法。如常绿(stay green)突变体是常见的苗期后叶色变异体，在拟南芥[11]、菊花[12]、羊茅[13](Festuca pratensis) 等很多物种中都有发现，其最明显的特征是生育末期叶片保绿时间较长甚至完全不黄化。常绿突变以外的苗期后叶色变异比较少见，通常根据突变发生时的叶色对突变体进行归类，这一类突变体中研究比较透彻的是来自于小麦矮变一号的返白突变体[14]。
1.1.2.3现有叶色突变分类
大多数水稻叶色突变体的显著特征是叶片表现为不正常的颜色，多数在苗期表达，出现诸如白化、黄化、浅绿、条纹、斑点等叶色表型，其中白化、黄化的叶色突变体出现最多。据不完全统计，目前水稻中已发现77个相关的叶色突变体，其中包括白化12个,黄化16个，条纹n个，转绿型14个，斑点14个等5大类型。
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