小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性分子机制研究
摘要：小麦纹枯病由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染引起，是我国冬小麦上的一种主要土传病害。噻呋酰胺是一类琥珀酸脱氢霉抑制剂类（succinate dehydrogenase inhibitor，SDHIs）杀菌剂，对R. cerealis有很好的抑制活性，但是小麦纹枯病菌对噻呋酰胺抗性机制还未有研究报道。本研究拟采用紫外诱变的方法筛选噻呋酰胺高抗突变体，通过比较敏感和抗性菌株中琥珀酸脱氢酶三个亚基（RCsdhB、RCsdhC和RCsdhD）的核苷酸和氨基酸序列，明确抗药性靶标基因以及突变位点，然后根据突变位点设计AS-PCR引物进行抗性突变菌株的分子检测。结果表明：在含25 μg/mL噻呋酰胺的平板上紫外诱变10 min获得8株突变体，突变频率为1.48%，8株突变体的抗性倍数为：3.6-32.3，抗性可稳定遗传。实验室其她人的研究，通过在含2 μg/mL噻呋酰胺的平板上紫外诱变10 min获得12株突变体，总计20株突变体中有7种突变类型，其中9株突变体以RCSdhD的116位的组氨酸（Histidine, H）突变为组氨酸（Histidine, H）和酪氨酸（Tyrosine, Y）的杂合体，4株突变体以RCSdhC的139位的组氨酸（Histidine, H）突变为纯和的酪氨酸（Tyrosine, Y）,有2株突变体在这三个基因上都未发生突变。根据RCSdhD的116位突变位点，设计的AS-PCR引物能够很好的区分该位点发生突变的抗性菌株，可用于田间该位点的抗性菌株分子检测。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1 培养基的配置5
1.1.2 供试菌株5
1.1.3 供试药剂5
1.1.4 主要设备6
1.2方法 6
1.2.1紫外诱变6
1.2.2 抗性突变体的敏感性测定6
1.2.3小麦纹枯病菌中琥珀酸脱氢酶sdhA, sdhB,sdhC和sdhD基因扩增和比较6
1.2.3.1噻呋酰胺敏感菌株和抗性突变体的DNA
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
和RNA提取6
1.2.3.2琥珀酸脱氢酶基因三个亚基sdhb、sdhc、sdhd基因克隆7
1.2.3.3 sdhb、sdhc、sdhd基因的克隆转化8
1.2.3.4 亲本与突变型菌株比较9
1.2.3.5 ASPCR引物检测9
1.2.4实验流程9
2结果与分析9
2.1抗性突变体的敏感性测定结果9
2.2 小麦纹枯病菌中琥珀酸脱氢酶三个亚基（RCsdhB、RCsdhC和RCsdhD）的克隆与分析10
2.3噻呋酰胺敏感菌株和抗性突变体中RCsdhB、RCsdhC和RCsdhD基因的氨基酸和核苷酸比较13
2.4RCSdhD的H116Y突变的ASPCR分子检测16
3讨论 16
致谢17
参考文献17
小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性分子机制研究
引言
引言 琥珀酸脱氢酶抑制剂类（succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs）杀菌剂是被杀菌剂抗性行动委员会新划分出来的一类作用机制和抗性机理相似的化合物，这类杀菌剂的作用机制主要是抑制病原菌琥珀酸脱氢酶活性，从而干扰其呼吸作用[1]。它们可被用于防治许多作物上的多种病害[23]，已成为生产上一类非常重要的杀菌剂品种。但随着该类药剂的广泛使用由于作用位点单一，其抗性问题也日益凸显[4]，是目前该类杀菌剂研究的热点之一。
SDHIs类杀菌剂的作用靶标位点为病原菌线粒体呼吸电子传递链上的蛋白复合体II，即琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)或琥珀酸泛醌还原酶(succinate ubiquinone reductase，SQR)。该酶复合体为三羧酸循环的功能部分，与线粒体电子传递链相连，催化从琥珀酸(succinate)氧化到延胡索酸(fumarate)和从泛醌(ubiquinone，即辅酶Q)还原到ubiquinol的偶联反应；它由黄素蛋白(Fp，SdhA)、铁硫蛋白(Ip，SdhB)和另外2种嵌膜蛋白(SdhC和SdhD)等4个亚单位共同组成。黄素蛋白内含1个共价结合的FAD辅因子，而铁硫蛋白内含3个铁硫中心——[2Fe2S]、[4Fe4S]和[3Fe4S]；另外2种嵌膜蛋白分别为大的细胞色素结合蛋白CybL和小的细胞色素结合蛋白CybS。黄素蛋白(SdhA)和铁硫蛋白(SdhB)组成该复合体的可溶性部分，具有琥珀酸脱氢酶活性；SdhC和SdhD这2种嵌膜蛋白将SdhA、SdhB固定在内膜上，且具有泛醌还原酶活性。 SDHIs类杀菌剂就是通过作用于蛋白复合体II影响病原菌的呼吸链电子传递系统，阻碍其能量的代谢，抑制病原菌的生长、导致其死亡，从而达到防治病害的目的。
早在1988年就有田间大麦散黑穗病菌对萎锈灵产生抗性的报导[5]。1991年，Keon[6]等检测到玉米瘤黑粉病菌对萎锈灵的抗性。1998年，Mattson[7]等研究发现在Paracoccus denitrificans中，SdhD 89位氨基酸的突变导致对萎锈灵产生抗性，Matsson[8]等于2001年还检测到该菌的另一种抗性突变型为SdhB(H228N)。2004年，Ito[9]等在研究Coprinus cinereus对氟酰胺抗性时，发现氟酰胺与萎锈灵存在交互抗性，抗性是由于SdhC基因80位上天冬酰胺(AAC)被替代为赖氨酸(AAA)所致，之前所发现对萎锈灵的抗性突变都发生在SdhB和SdhD亚单位上。 2009年，Shima[10]等检测了米曲霉菌(Aspergillus oryzae )对抗萎锈灵突变体的3个突变位点，这3个突变位点分别位于SdhB、SdhC和SdhD三个亚单位上。
2007年，Stammler[11]等研究结果表明：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea )对啶酰菌胺的抗性是由于SdhB亚单位第225位和272位上的氨基酸突变所致，同年，巴斯夫公司还报道了Botrytis elliptica在SdhB亚单位位于272位上的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸或精氨酸而对啶酰菌胺产生抗性。2008年，Avenot[12]等监测到对啶酰菌胺具极高水平抗性的A. alternata菌株(EC50>500 mg/L，菌丝生长速率法)，并且与萎锈灵存在交互抗药性，通过比对抗性菌株和敏感菌株的SdhB全序列发现有2种抗性突变型分别为277位上的组氨酸(CAC)转变为酪氨酸(TAC)或精氨酸(CGC)。，2007年，Stevenson[13]等在田间检测到因SdhB亚单位上的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸而引起西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae )对啶酰菌胺的抗性菌株
小麦纹枯病又称小麦尖眼点病，主要是由禾谷丝核菌Ｒhizoctonia cerealis Van der Hoeven 引起的一种土传真菌病害，该病在世界主要小麦产区均有发生［14 － 15］。近年来，小麦纹枯病在我国呈现明显北移趋势，对北方冬麦区危害日益严重，已成为冬小麦优质高产的严重障碍之一［16 － 17］。虽然已初步获得稳定的小麦纹枯病抗源，但尚无较好的抗病品种应用于生产［18 － 19］。目前我国对该病的防治主要是采用三唑类杀菌剂拌种或喷施井冈霉素。由于长期大量使用单一或同类杀菌剂，小麦纹枯病菌已出现对药剂敏感性降低现象或产生了不同程度的抗药性，化学防治效果明显下降［20 － 22］。
引进新的杀菌剂来提高对小麦纹枯病的防效、延缓和避免抗药性的发生迫在眉睫。噻呋酰胺（Thifluzamide，满穗）是美国陶氏益农公司开发的SDHIs杀菌剂，对丝核菌有特效，目前已在中国登记用于水稻纹枯病的防治[23]。在前期研究中本实验室探索了噻呋酰胺对小麦纹枯病菌（R.cerealis）的离体抑制活性和大田的防病效果。结果表明噻呋酰胺对小麦纹枯病菌的菌丝生长有强烈的抑制活性（平均EC50为0.05 μg/mL），24%噻呋酰胺SC对小麦纹枯病病情指数防效和病株率防效分别为74.92%和62.05%，显著优于井冈霉素，说明噻呋酰胺在小麦纹枯病的防治中可能具有良好的应用前景。
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1 培养基的配置5
1.1.2 供试菌株5
1.1.3 供试药剂5
1.1.4 主要设备6
1.2方法 6
1.2.1紫外诱变6
1.2.2 抗性突变体的敏感性测定6
1.2.3小麦纹枯病菌中琥珀酸脱氢酶sdhA, sdhB,sdhC和sdhD基因扩增和比较6
1.2.3.1噻呋酰胺敏感菌株和抗性突变体的DNA
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
和RNA提取6
1.2.3.2琥珀酸脱氢酶基因三个亚基sdhb、sdhc、sdhd基因克隆7
1.2.3.3 sdhb、sdhc、sdhd基因的克隆转化8
1.2.3.4 亲本与突变型菌株比较9
1.2.3.5 ASPCR引物检测9
1.2.4实验流程9
2结果与分析9
2.1抗性突变体的敏感性测定结果9
2.2 小麦纹枯病菌中琥珀酸脱氢酶三个亚基（RCsdhB、RCsdhC和RCsdhD）的克隆与分析10
2.3噻呋酰胺敏感菌株和抗性突变体中RCsdhB、RCsdhC和RCsdhD基因的氨基酸和核苷酸比较13
2.4RCSdhD的H116Y突变的ASPCR分子检测16
3讨论 16
致谢17
参考文献17
小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性分子机制研究
引言
引言 琥珀酸脱氢酶抑制剂类（succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs）杀菌剂是被杀菌剂抗性行动委员会新划分出来的一类作用机制和抗性机理相似的化合物，这类杀菌剂的作用机制主要是抑制病原菌琥珀酸脱氢酶活性，从而干扰其呼吸作用[1]。它们可被用于防治许多作物上的多种病害[23]，已成为生产上一类非常重要的杀菌剂品种。但随着该类药剂的广泛使用由于作用位点单一，其抗性问题也日益凸显[4]，是目前该类杀菌剂研究的热点之一。
SDHIs类杀菌剂的作用靶标位点为病原菌线粒体呼吸电子传递链上的蛋白复合体II，即琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)或琥珀酸泛醌还原酶(succinate ubiquinone reductase，SQR)。该酶复合体为三羧酸循环的功能部分，与线粒体电子传递链相连，催化从琥珀酸(succinate)氧化到延胡索酸(fumarate)和从泛醌(ubiquinone，即辅酶Q)还原到ubiquinol的偶联反应；它由黄素蛋白(Fp，SdhA)、铁硫蛋白(Ip，SdhB)和另外2种嵌膜蛋白(SdhC和SdhD)等4个亚单位共同组成。黄素蛋白内含1个共价结合的FAD辅因子，而铁硫蛋白内含3个铁硫中心——[2Fe2S]、[4Fe4S]和[3Fe4S]；另外2种嵌膜蛋白分别为大的细胞色素结合蛋白CybL和小的细胞色素结合蛋白CybS。黄素蛋白(SdhA)和铁硫蛋白(SdhB)组成该复合体的可溶性部分，具有琥珀酸脱氢酶活性；SdhC和SdhD这2种嵌膜蛋白将SdhA、SdhB固定在内膜上，且具有泛醌还原酶活性。 SDHIs类杀菌剂就是通过作用于蛋白复合体II影响病原菌的呼吸链电子传递系统，阻碍其能量的代谢，抑制病原菌的生长、导致其死亡，从而达到防治病害的目的。
早在1988年就有田间大麦散黑穗病菌对萎锈灵产生抗性的报导[5]。1991年，Keon[6]等检测到玉米瘤黑粉病菌对萎锈灵的抗性。1998年，Mattson[7]等研究发现在Paracoccus denitrificans中，SdhD 89位氨基酸的突变导致对萎锈灵产生抗性，Matsson[8]等于2001年还检测到该菌的另一种抗性突变型为SdhB(H228N)。2004年，Ito[9]等在研究Coprinus cinereus对氟酰胺抗性时，发现氟酰胺与萎锈灵存在交互抗性，抗性是由于SdhC基因80位上天冬酰胺(AAC)被替代为赖氨酸(AAA)所致，之前所发现对萎锈灵的抗性突变都发生在SdhB和SdhD亚单位上。 2009年，Shima[10]等检测了米曲霉菌(Aspergillus oryzae )对抗萎锈灵突变体的3个突变位点，这3个突变位点分别位于SdhB、SdhC和SdhD三个亚单位上。
2007年，Stammler[11]等研究结果表明：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea )对啶酰菌胺的抗性是由于SdhB亚单位第225位和272位上的氨基酸突变所致，同年，巴斯夫公司还报道了Botrytis elliptica在SdhB亚单位位于272位上的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸或精氨酸而对啶酰菌胺产生抗性。2008年，Avenot[12]等监测到对啶酰菌胺具极高水平抗性的A. alternata菌株(EC50>500 mg/L，菌丝生长速率法)，并且与萎锈灵存在交互抗药性，通过比对抗性菌株和敏感菌株的SdhB全序列发现有2种抗性突变型分别为277位上的组氨酸(CAC)转变为酪氨酸(TAC)或精氨酸(CGC)。，2007年，Stevenson[13]等在田间检测到因SdhB亚单位上的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸而引起西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae )对啶酰菌胺的抗性菌株
小麦纹枯病又称小麦尖眼点病，主要是由禾谷丝核菌Ｒhizoctonia cerealis Van der Hoeven 引起的一种土传真菌病害，该病在世界主要小麦产区均有发生［14 － 15］。近年来，小麦纹枯病在我国呈现明显北移趋势，对北方冬麦区危害日益严重，已成为冬小麦优质高产的严重障碍之一［16 － 17］。虽然已初步获得稳定的小麦纹枯病抗源，但尚无较好的抗病品种应用于生产［18 － 19］。目前我国对该病的防治主要是采用三唑类杀菌剂拌种或喷施井冈霉素。由于长期大量使用单一或同类杀菌剂，小麦纹枯病菌已出现对药剂敏感性降低现象或产生了不同程度的抗药性，化学防治效果明显下降［20 － 22］。
引进新的杀菌剂来提高对小麦纹枯病的防效、延缓和避免抗药性的发生迫在眉睫。噻呋酰胺（Thifluzamide，满穗）是美国陶氏益农公司开发的SDHIs杀菌剂，对丝核菌有特效，目前已在中国登记用于水稻纹枯病的防治[23]。在前期研究中本实验室探索了噻呋酰胺对小麦纹枯病菌（R.cerealis）的离体抑制活性和大田的防病效果。结果表明噻呋酰胺对小麦纹枯病菌的菌丝生长有强烈的抑制活性（平均EC50为0.05 μg/mL），24%噻呋酰胺SC对小麦纹枯病病情指数防效和病株率防效分别为74.92%和62.05%，显著优于井冈霉素，说明噻呋酰胺在小麦纹枯病的防治中可能具有良好的应用前景。
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