蒺藜苜蓿mtric8基因的克隆及过量表达
豆科的模式植物——蒺藜苜蓿?(Medicago truncatula)目前是研究豆科植物和根瘤菌共生互作过程中信号调控的理想材料。植物中有一类特殊的小G蛋白ROP，其在囊泡的运输、信号的转导以及细胞的极性生长历程中起到了关键作用，而本文中的RIC家族是基于ROP的一种下游效应子。本研究通过建立高效的蒺藜苜蓿遗传转化体系，将RIC家族中的一个基因MtRIC8进行克隆及遗传转化，为进一步研究其在结瘤因子诱导的根毛变形过程中的功能以及研究豆科植物与根瘤菌共生互作信号调控机理奠定基础。实验结果综述为以下(1)采用PCR技术扩增了RIC8基因，连接到pCAMBIA3301载体上构建了RIC8过表达载体；(2)通过侵染、共培养、诱导胚性愈伤及筛选、体胚发生等步骤获得了过表达植株；(3)对由第(2)步获得的植株进行PCR鉴定，结果表明遗传转化是成功的。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 绪论1
1.1根瘤共生的过程2
1.2 ROP家族基因3
1.2.1 ROP家族简介3
1.2.2 RIC家族简介4
1.3 蒺藜苜蓿的遗传转化5
1.4 研究的目的和意义5
2 材料与方法6
2.1 材料6
2.1.1植物材料6
2.1.2 克隆载体与菌株6
2.1.3 工具酶、抗生素及常用试剂6
2.1.4 培养基6
2.1.5 主要仪器和设备7
2.2 方法7
2.2.1 蒺藜苜蓿RNA的提取7
2.2.2 mRNA的反转录7
2.2.3 PCR扩增目的基因片段并回收8
2.2.4 目的基因转化载体并连接大肠杆菌8
2.2.5 质粒的提取8
2.2.6 质粒转化农杆菌8
2.2.7 转基因植株的获得8
2.2.8 植株DNA的提取鉴定9
3 结果与分析9
3.1 MtRIC8过表达载体的构建9
3.2 蒺藜苜蓿RIC8过表达植株的获得 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
10
3.3 转基因植株的PCR检测11
4 讨论12
致谢12
参考文献12
蒺藜苜蓿MtRIC8基因的克隆及过量表达
引言
1 绪论
现今我国的环境问题日渐严峻，水资源分布不均匀，水土流失严重，荒漠化面积扩大，草地退化面积增加，物种多样性严重损坏。氮元素是构成生命的基本元素之一，虽然空气中有大量的氮气，但是化肥工业上只有在高温高压条件 (470520 °C，2.03×1075.07×107 Pa) 下气态氮才得以转化为肥料氮，而自然界中豆科植物在常温常压条件下与根瘤菌共生即可固定氮气[1]。因此，豆科植物共生固氮成本低廉且较为环保和节省资源。作为一种农作物，豆科植物可以作为人类食物中植物蛋白的重要来源以及作为绿肥来提高土壤肥力，且该类植物根部通过与固氮微生物共生能够直接转化氮气为生物可利用的氨。研究表明，生物圈中的生物固氮量有80%是来源于豆科植物和根瘤菌的共生固氮[2] ，现代农业中豆科植物的共生固氮是解决土壤养分缺失，避免过量氮肥污染的重要渠道。在此过程中，大量的信号交流发生在宿主植物和根瘤菌之间，它们相互交叉、相互衔接，形成一个庞大的信号调节网络[3]，植物小G蛋白ROP是其重要的信号调节分子之一。
植物小G蛋白ROP (Rhorelated GTPase from plants) 在细胞的生命历程中起到了重要的信号调节作用，但目前对其在共生过程中究竟如何调控信号的传递还知之甚少[4]。对于豆科小G蛋白ROP的深入研究不仅可以揭示该蛋白在豆科植物共生过程中的信号转导机理。RIC (Ropinteractive CRIB motifcontaining proteins) 家族是一种公认的ROP下游效应子，该基因家族参与了许多植物的生理过程。
蒺藜苜蓿是豆科苜蓿属的一年生植物，作为新型的豆科模式植物其具有其他植物无法比拟的优势。首先，蒺藜苜蓿是二倍体 (2n=16 条染色体) 植物，遗传学简单；再者，蒺藜苜蓿再生时间短且有大量突变体和生态型，具有较高的生物多样性 (Barker等，1990)；此外，许多豆科植物 (如紫花苜蓿、大豆、豌豆) 和蒺藜苜蓿都有遗传相似性，对于蒺藜苜蓿的研究广泛适用于其他植物[5]。蒺藜苜蓿是继拟南芥和水稻基因组测序之后的又一个大规模基因组测序的植物[6]。
1.1 根瘤共生的过程
根瘤的形成主要分为以下四个阶段。首先，在根毛处根瘤菌先进行侵染并在植物根际进行繁殖，根毛细胞变形弯曲；再者根瘤菌诱导根毛细胞形成一种管状结构即侵染线；然后是根皮层细胞分裂形成根瘤原基；最后根瘤原基分化形成各种根瘤组织，进一步形成成熟的固氮根瘤。植物和微生物间的信号交换是根瘤共生所必须的，结瘤因子(脂壳寡糖,lipochitooligosaccharides,LCOs)是宿主植物在根系分泌类黄酮后根瘤菌合成并分泌的一类多糖信号分子，共生结瘤的过程中起关键作用[7]，通过对根瘤共生的研究表明豆科植物可以识别结瘤因子。具体过程如图11所示。曾有实验研究称，仅用结瘤因子处理根毛10分钟就可以诱导根毛的变形，变形后再撤去结瘤因子变形不会立刻停止。
图11 共生结瘤早期结瘤因子的信号转导途径[8]
1.2 ROP家族基因
1.2.1 ROP家族简介
小G蛋白 (small GTPases) 是细胞信号转导中重要蛋白的一种，分为Ras、Rho、Rab、Arf和Ran等5个亚家族[9]。Rho家族中有着一种特殊小G蛋白——ROP (Rhorelated GTPase from plants) ，其功能主要是调控细胞生长发育及建立植物防御反应体系。具体来说，ROP家族基因的作用(图12)有调节花粉管的伸长、调节植物的防御反应、调节顶端分生组织的发育、影响根毛的发育等[10]。在以往对拟南芥等植物的研究中发现，ROPs对根毛的调节方式复杂，种类多样，例如调节根毛的密度和数量、根毛的尖端生长、根毛长度的增加以及根毛的卷曲等[9]。在对紫花苜蓿的研究中发现，接种根瘤菌后，MtROP3，MtROP5和MtROP6基因呈上调表达，与受根瘤菌诱导的标记基因NFP，Ripl和Enodll的表达情况一致。有研究发现，在蒺藜苜蓿中，MtROP10位于根毛顶端的质膜处且参与了根毛的顶端生长过程。在接种根瘤菌之后，根毛中MtROP10的表达在结瘤因子的诱导下出现上调现象，同时MtROP10异位定位于根瘤菌诱导形成的根毛突起和卷曲的部位，它通过影响侵染线形成过程中根毛的卷曲变形过程参与豆科植物的共生固氮[11]，与结瘤因子NF (Nodular factor) 受体之间存在相互作用关系，与此同时ROP10过量表达和持续激活型突变体ROP10 CA也可增强NF信号途径的作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 绪论1
1.1根瘤共生的过程2
1.2 ROP家族基因3
1.2.1 ROP家族简介3
1.2.2 RIC家族简介4
1.3 蒺藜苜蓿的遗传转化5
1.4 研究的目的和意义5
2 材料与方法6
2.1 材料6
2.1.1植物材料6
2.1.2 克隆载体与菌株6
2.1.3 工具酶、抗生素及常用试剂6
2.1.4 培养基6
2.1.5 主要仪器和设备7
2.2 方法7
2.2.1 蒺藜苜蓿RNA的提取7
2.2.2 mRNA的反转录7
2.2.3 PCR扩增目的基因片段并回收8
2.2.4 目的基因转化载体并连接大肠杆菌8
2.2.5 质粒的提取8
2.2.6 质粒转化农杆菌8
2.2.7 转基因植株的获得8
2.2.8 植株DNA的提取鉴定9
3 结果与分析9
3.1 MtRIC8过表达载体的构建9
3.2 蒺藜苜蓿RIC8过表达植株的获得 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
10
3.3 转基因植株的PCR检测11
4 讨论12
致谢12
参考文献12
蒺藜苜蓿MtRIC8基因的克隆及过量表达
引言
1 绪论
现今我国的环境问题日渐严峻，水资源分布不均匀，水土流失严重，荒漠化面积扩大，草地退化面积增加，物种多样性严重损坏。氮元素是构成生命的基本元素之一，虽然空气中有大量的氮气，但是化肥工业上只有在高温高压条件 (470520 °C，2.03×1075.07×107 Pa) 下气态氮才得以转化为肥料氮，而自然界中豆科植物在常温常压条件下与根瘤菌共生即可固定氮气[1]。因此，豆科植物共生固氮成本低廉且较为环保和节省资源。作为一种农作物，豆科植物可以作为人类食物中植物蛋白的重要来源以及作为绿肥来提高土壤肥力，且该类植物根部通过与固氮微生物共生能够直接转化氮气为生物可利用的氨。研究表明，生物圈中的生物固氮量有80%是来源于豆科植物和根瘤菌的共生固氮[2] ，现代农业中豆科植物的共生固氮是解决土壤养分缺失，避免过量氮肥污染的重要渠道。在此过程中，大量的信号交流发生在宿主植物和根瘤菌之间，它们相互交叉、相互衔接，形成一个庞大的信号调节网络[3]，植物小G蛋白ROP是其重要的信号调节分子之一。
植物小G蛋白ROP (Rhorelated GTPase from plants) 在细胞的生命历程中起到了重要的信号调节作用，但目前对其在共生过程中究竟如何调控信号的传递还知之甚少[4]。对于豆科小G蛋白ROP的深入研究不仅可以揭示该蛋白在豆科植物共生过程中的信号转导机理。RIC (Ropinteractive CRIB motifcontaining proteins) 家族是一种公认的ROP下游效应子，该基因家族参与了许多植物的生理过程。
蒺藜苜蓿是豆科苜蓿属的一年生植物，作为新型的豆科模式植物其具有其他植物无法比拟的优势。首先，蒺藜苜蓿是二倍体 (2n=16 条染色体) 植物，遗传学简单；再者，蒺藜苜蓿再生时间短且有大量突变体和生态型，具有较高的生物多样性 (Barker等，1990)；此外，许多豆科植物 (如紫花苜蓿、大豆、豌豆) 和蒺藜苜蓿都有遗传相似性，对于蒺藜苜蓿的研究广泛适用于其他植物[5]。蒺藜苜蓿是继拟南芥和水稻基因组测序之后的又一个大规模基因组测序的植物[6]。
1.1 根瘤共生的过程
根瘤的形成主要分为以下四个阶段。首先，在根毛处根瘤菌先进行侵染并在植物根际进行繁殖，根毛细胞变形弯曲；再者根瘤菌诱导根毛细胞形成一种管状结构即侵染线；然后是根皮层细胞分裂形成根瘤原基；最后根瘤原基分化形成各种根瘤组织，进一步形成成熟的固氮根瘤。植物和微生物间的信号交换是根瘤共生所必须的，结瘤因子(脂壳寡糖,lipochitooligosaccharides,LCOs)是宿主植物在根系分泌类黄酮后根瘤菌合成并分泌的一类多糖信号分子，共生结瘤的过程中起关键作用[7]，通过对根瘤共生的研究表明豆科植物可以识别结瘤因子。具体过程如图11所示。曾有实验研究称，仅用结瘤因子处理根毛10分钟就可以诱导根毛的变形，变形后再撤去结瘤因子变形不会立刻停止。
图11 共生结瘤早期结瘤因子的信号转导途径[8]
1.2 ROP家族基因
1.2.1 ROP家族简介
小G蛋白 (small GTPases) 是细胞信号转导中重要蛋白的一种，分为Ras、Rho、Rab、Arf和Ran等5个亚家族[9]。Rho家族中有着一种特殊小G蛋白——ROP (Rhorelated GTPase from plants) ，其功能主要是调控细胞生长发育及建立植物防御反应体系。具体来说，ROP家族基因的作用(图12)有调节花粉管的伸长、调节植物的防御反应、调节顶端分生组织的发育、影响根毛的发育等[10]。在以往对拟南芥等植物的研究中发现，ROPs对根毛的调节方式复杂，种类多样，例如调节根毛的密度和数量、根毛的尖端生长、根毛长度的增加以及根毛的卷曲等[9]。在对紫花苜蓿的研究中发现，接种根瘤菌后，MtROP3，MtROP5和MtROP6基因呈上调表达，与受根瘤菌诱导的标记基因NFP，Ripl和Enodll的表达情况一致。有研究发现，在蒺藜苜蓿中，MtROP10位于根毛顶端的质膜处且参与了根毛的顶端生长过程。在接种根瘤菌之后，根毛中MtROP10的表达在结瘤因子的诱导下出现上调现象，同时MtROP10异位定位于根瘤菌诱导形成的根毛突起和卷曲的部位，它通过影响侵染线形成过程中根毛的卷曲变形过程参与豆科植物的共生固氮[11]，与结瘤因子NF (Nodular factor) 受体之间存在相互作用关系，与此同时ROP10过量表达和持续激活型突变体ROP10 CA也可增强NF信号途径的作用。
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