水稻白叶枯病菌gumm的基因克隆及其敲体对噻枯唑的药敏性测定
水稻白叶枯病（rice bacterial blight）是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的一种重要的细菌性病害。由于长期单一的使用杀菌剂噻枯唑进行防治，水稻白叶枯病菌抗药性的产生使噻枯唑防效大幅度下降。研究表明，水稻白叶枯对噻枯唑的离体抗性菌株其胞外多糖的产量比触发敏感菌株明显下降，为了研究胞外多糖基因gumM与水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性的关系，本项目以水稻白叶枯病菌为靶标生物，构建胞外多糖基因gumM的敲除载体，将gumM基因进行敲除，测定敲除体对噻枯唑的敏感性及其生物学特性。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 4
1.2.1构建敲除载体4
1.2.2敲除zj173的gumM基因7
1.2.3测定敲除体的EC50和活体抗药性8
2结果与讨论9
2.1构建zj173⊿gumM9
2.2测定敲除体的EC50和活体抗药性9
3讨论10
致谢10
参考文献10
水稻白叶枯病菌gumM的基因克隆及其敲除体对噻枯唑的药敏性测定
引言
水稻白叶枯病（rice bacterial blight）是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的一种细菌性病害，是亚洲热带及亚热带地区重要的水稻病害之一（Salzberg et al，2008；Strange & Scott，2005；Jeung et al，2006）。水稻白叶枯病在我国南方地区水稻产区发生较严重，在条件适合的情况下，可造成水稻产量10%以上的损失（陈功友等，2004；Salzberg et al，2008）。种植抗病品种是生产上控制水稻白叶枯病的主要措施，但因X. oryzae pv. oryzae致病性的变异和新毒性群体的出现，往往使抗病品种在推广种植几年后丧失抗病性（陈功友等，2004），因此使用药剂防治依然是当前防治该病害不可缺 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
少的重要手段。
噻枯唑（bismerthiazol）又名川化018 、叶青双、叶枯唑，化学名称：N，N甲撑双（2氨基5巯基1，3，4噻二唑），是目前生产上常用的防治水稻白叶枯病害（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的药剂（马忠华等，1997）。自20世纪70年代以来一直作为防治水稻白叶枯病的主要农药品种。王文相等研究发现, 在稻株上重复使用噻枯唑后, 水稻白叶枯病菌对其敏感性明显下降（王文相等，1992）。马忠华等认为, 在已有多年用药历史的水稻白叶枯病老病区, 病菌对噻枯唑的抗药性已经形成（马忠华等，1996）
已有的研究结果表明室内筛选的抗噻枯唑的水稻白叶枯病菌在活体寄主（水稻）上致病性丧失或下降（周明国等，1997），而活体上获得的抗噻枯唑菌株在离体下不表现抗药性（周明国等，1997；王文相等，1998），因而噻枯唑在离体和活体上的作用机制不同，这一观点已被研究者认可。迄今为至，获得的对噻枯唑具有离体抗性的菌株均为低抗菌株，未见5倍以上的抗药性菌株（周明国等，1997；王文相，1998）。另外活体上抗性菌株产生的速度很快，抗性指数很高。王文相连续3轮喷噻枯唑500μg/mL，回收后重新接种，防效分别为88%、10%和0，最低抑制浓度的抗性指数大于196（王文相等，1998）。
最近研究表明，水稻白叶枯对噻枯唑的离体抗性菌株其胞外多糖的产量比出发敏感菌株明显下降（张宇俊，2005；马忠华，1997）。水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）的胞外多糖基因簇由12个开放阅读框组成，分别是gumB, gumC, gumD, gumE, gumF, gumG ,gumH, gumI, gumJ, gumK, gumL, and gumM (Yoon and Cho 2007; Lee et al. 2008)。gumI敲除体及gumM插入突变体的胞外多糖产量均有显著性下降（Yoon et al. 2009）。
为了研究胞外多糖基因gumM与水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性的关系，本项目拟以水稻白叶枯病菌为靶标生物，构建胞外多糖基因gumM的敲除载体，将gumM基因进行敲除，测定敲除体对噻枯唑的敏感性及其生物学特性。研究成果将不仅为噻枯唑的安全和合理使用提供科学指导，为有效延长药剂使用寿命、延缓抗药性形成等奠定理论基础，而且有助于发现新的作用靶标，为基于作用靶标的新农药分子合理设计提供理论依据，有助于研发人员对药剂原有化学结构进一步优化，创制出更加高效、低毒、广谱和环境相容的杀菌剂。
1 材料与方法
1．1材料
1.1.1菌株和质粒
本研究所用的菌株为zj173，适宜的生长温度为28℃。大肠杆菌DH5a最适宜生长温度为37℃。
1.1.2 引物（如下表）
片段名称
片段序列
酶切位点
上游片段引物
gumMupF
5’CGGGATCCGGATCTGAGCAAGAAGCT3’
BamHI
gumMupR
5’GGGGTACC CCAAAGGTCGTAAGGGA3’
KpnI
下游片段引物
gumMdownF
5’GGGGTACC GAAGGCGGGCACTAC3’
KpnI
gumMdownR
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 4
1.2.1构建敲除载体4
1.2.2敲除zj173的gumM基因7
1.2.3测定敲除体的EC50和活体抗药性8
2结果与讨论9
2.1构建zj173⊿gumM9
2.2测定敲除体的EC50和活体抗药性9
3讨论10
致谢10
参考文献10
水稻白叶枯病菌gumM的基因克隆及其敲除体对噻枯唑的药敏性测定
引言
水稻白叶枯病（rice bacterial blight）是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的一种细菌性病害，是亚洲热带及亚热带地区重要的水稻病害之一（Salzberg et al，2008；Strange & Scott，2005；Jeung et al，2006）。水稻白叶枯病在我国南方地区水稻产区发生较严重，在条件适合的情况下，可造成水稻产量10%以上的损失（陈功友等，2004；Salzberg et al，2008）。种植抗病品种是生产上控制水稻白叶枯病的主要措施，但因X. oryzae pv. oryzae致病性的变异和新毒性群体的出现，往往使抗病品种在推广种植几年后丧失抗病性（陈功友等，2004），因此使用药剂防治依然是当前防治该病害不可缺 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
少的重要手段。
噻枯唑（bismerthiazol）又名川化018 、叶青双、叶枯唑，化学名称：N，N甲撑双（2氨基5巯基1，3，4噻二唑），是目前生产上常用的防治水稻白叶枯病害（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的药剂（马忠华等，1997）。自20世纪70年代以来一直作为防治水稻白叶枯病的主要农药品种。王文相等研究发现, 在稻株上重复使用噻枯唑后, 水稻白叶枯病菌对其敏感性明显下降（王文相等，1992）。马忠华等认为, 在已有多年用药历史的水稻白叶枯病老病区, 病菌对噻枯唑的抗药性已经形成（马忠华等，1996）
已有的研究结果表明室内筛选的抗噻枯唑的水稻白叶枯病菌在活体寄主（水稻）上致病性丧失或下降（周明国等，1997），而活体上获得的抗噻枯唑菌株在离体下不表现抗药性（周明国等，1997；王文相等，1998），因而噻枯唑在离体和活体上的作用机制不同，这一观点已被研究者认可。迄今为至，获得的对噻枯唑具有离体抗性的菌株均为低抗菌株，未见5倍以上的抗药性菌株（周明国等，1997；王文相，1998）。另外活体上抗性菌株产生的速度很快，抗性指数很高。王文相连续3轮喷噻枯唑500μg/mL，回收后重新接种，防效分别为88%、10%和0，最低抑制浓度的抗性指数大于196（王文相等，1998）。
最近研究表明，水稻白叶枯对噻枯唑的离体抗性菌株其胞外多糖的产量比出发敏感菌株明显下降（张宇俊，2005；马忠华，1997）。水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）的胞外多糖基因簇由12个开放阅读框组成，分别是gumB, gumC, gumD, gumE, gumF, gumG ,gumH, gumI, gumJ, gumK, gumL, and gumM (Yoon and Cho 2007; Lee et al. 2008)。gumI敲除体及gumM插入突变体的胞外多糖产量均有显著性下降（Yoon et al. 2009）。
为了研究胞外多糖基因gumM与水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性的关系，本项目拟以水稻白叶枯病菌为靶标生物，构建胞外多糖基因gumM的敲除载体，将gumM基因进行敲除，测定敲除体对噻枯唑的敏感性及其生物学特性。研究成果将不仅为噻枯唑的安全和合理使用提供科学指导，为有效延长药剂使用寿命、延缓抗药性形成等奠定理论基础，而且有助于发现新的作用靶标，为基于作用靶标的新农药分子合理设计提供理论依据，有助于研发人员对药剂原有化学结构进一步优化，创制出更加高效、低毒、广谱和环境相容的杀菌剂。
1 材料与方法
1．1材料
1.1.1菌株和质粒
本研究所用的菌株为zj173，适宜的生长温度为28℃。大肠杆菌DH5a最适宜生长温度为37℃。
1.1.2 引物（如下表）
片段名称
片段序列
酶切位点
上游片段引物
gumMupF
5’CGGGATCCGGATCTGAGCAAGAAGCT3’
BamHI
gumMupR
5’GGGGTACC CCAAAGGTCGTAAGGGA3’
KpnI
下游片段引物
gumMdownF
5’GGGGTACC GAAGGCGGGCACTAC3’
KpnI
gumMdownR
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