水稻中水杨酸缓解稻瘟病菌侵染相关蛋白的鉴定
采用蛋白质双向电泳技术，分析了水稻稻瘟病感病品种“日本晴”叶片经稻瘟病菌侵染后、喷施水杨酸前后的蛋白质差异。以差异1.5倍为标准，鉴定出18个与水杨酸缓解稻瘟病菌侵染相关差异蛋白，经质谱分析及在线搜库，确认这些蛋白的身份及其参与的代谢途径。从蛋白质组学水平上初步阐明水杨酸缓解稻瘟病菌侵染的分子机理，为稻瘟病研究及抗病育种提供理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 供试水稻的培养及稻瘟病菌侵染 2
1.2.2 水稻叶片蛋白提取 2
1.2.3 水稻叶片蛋白样品制备 2
1.2.4 水稻叶片蛋白浓度测定 2
1.2.5 蛋白样品等电聚焦（IEF）及胶条平衡3
1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）3
1.2.7 凝胶染色 3
1.2.8 图像采集及差异点分析 4
1.2.9 差异蛋白质质谱鉴定 4
2 结果与分析4
2.1供试材料双向电泳分析 4
2.2差异蛋白的质谱鉴定 5
2.3差异表达蛋白功能分类 5
3讨论6
3.1 信号转导相关蛋白 6
3.2能量代谢相关蛋白6
3.3蛋白合成相关蛋白6
3.4蛋白水解相关蛋白6
3.5 活性氧清除相关蛋白 7
致谢7
参考文献8
水稻中水杨酸缓解稻瘟病菌侵染相关蛋白的鉴定
引言
水稻是我国重要的粮食作物，由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是危害水稻最严重的“三大病害”之一，属世界性病害[1]。近年来，由于品种抗性、施肥水平、气候条件等因素的影响，稻瘟病的危害越来越严重。因此，如何防治和减少稻瘟病的发生，长期以来是我国粮食安全生产的主要任务之一[2]。实践证明，抗病品种的培育和种植是控制该病害最为经济、安全和有效的方法[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
34]。随着分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用，筛选与稻瘟病菌抗性相关的关键蛋白，是水稻抗病育种的一个重要工作，解决水稻抗病的分子机制这一复杂问题已渐露端倪[5]。
蛋白质组学研究着重于全面性和整体性，研究的对象是从整体水平上对蛋白质的表达和功能进行研究，包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因——核酸层次，深入到生命的直接执行者——蛋白质水平。蛋白质组研究已成为后基因组时代的主要任务[6]。目前，国内水稻抗稻瘟病蛋白质组学研究并不够深入，仅见张智慧等以抗稻瘟病水稻近等基因系为材料，应用差异蛋白质组学技术对外源茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的水稻叶片蛋白质差异表达变化进行了分析，结果鉴定了21个差异表达蛋白，并将这些蛋白功能分为8类，分别在植物抗性、氨基酸代谢、信号转导、光合作用、光呼吸、糖代谢、蛋白质合成与分解及细胞代谢等方面发挥作用[7]。
水杨酸( salicylic acid,SA)是植物体内的小分子物质, 具有多种重要的生理功能, 是一种新的植物激素, 并与植物的抗病性密切相关[89]。已有的研究结果表明, 水杨酸喷雾处理水稻后,可显著提高水稻对稻瘟病的抗性, 且水杨酸诱导水稻的幼苗体内与抗菌物质合成酶的活性密切相关[910]。鉴于此，笔者采用双向电泳、串联质谱等蛋白质组学技术，分析并鉴定了稻瘟病感病种质叶片经稻瘟病菌侵染后，喷施水杨酸前后的蛋白质差异，分析水杨酸相关差异蛋白的生物信息学功能，以期从蛋白质水平初步阐明水杨酸缓解稻瘟病菌侵染相关蛋白的作用过程和原理。
1 材料与方法
1．1 实验材料
稻瘟病敏感品种“日本晴”由大学农学院水稻所提供。稻瘟菌株（Guy11）由大学植物保护学院真菌学实验室提供。
1．2 实验方法
1．2．1 供试水稻的培养及稻瘟病菌侵染
选取200粒大小相近、颗粒饱满的稻瘟病敏感品种“日本晴”水稻种子，用70%酒精表面消毒后，浸泡在水中催芽。待其发芽，播种于浇有营养液的土盆中（每盆均匀播20粒，共9盆）。待水稻生长至二叶一心期，将9盆水稻随机分为3组（每组3盆）分别标记为CK、M、SA。对M组、SA组均匀喷施稻瘟病菌Guy11（菌浓度为5x104个/ml），再对SA组喷施水杨酸，CK组喷施水。水稻培养过程中，均放于温室中培养（温度：2527℃，光照时间：12h/d），每天中午查看水稻生长情况，及时浇水。待喷施后第7天时，同时取各组水稻叶片各3份，每份约1g，自封袋密封保存、做好标记，立即放入超低温冰箱中冷冻，待提取蛋白用。实验设三次重复。
1．2．2 水稻叶片蛋白提取
采用三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取水稻叶片总蛋白：
①洗净干燥的研钵中，加入适量PVP40，加液氮，放入水稻叶片（约1g），快速磨成粉末；
②将粉末转移至50ml的离心管中，加入30ml左右冷冻状态下的0.1%DTT、10%TCA/丙酮溶液，20℃沉淀2h，期间间歇摇匀；
③10000rpm，4℃，离心15min；
④弃去上清溶液，留下沉淀，加30ml冷丙酮，20℃沉淀1h；
⑤重复③④步骤，待沉淀为白色时即可；
⑥将沉淀37℃干燥成白色蛋白粉末，放于20℃冰箱保存，待用。
1．2．3 水稻叶片蛋白样品制备
取蛋白粉末约1mg，加入800μl左右裂解液，室温溶解。待白色粉末充分溶解， 10000rpm条件下，离心15min，取上清，待后续测定蛋白浓度。裂解液配方如下：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 供试水稻的培养及稻瘟病菌侵染 2
1.2.2 水稻叶片蛋白提取 2
1.2.3 水稻叶片蛋白样品制备 2
1.2.4 水稻叶片蛋白浓度测定 2
1.2.5 蛋白样品等电聚焦（IEF）及胶条平衡3
1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）3
1.2.7 凝胶染色 3
1.2.8 图像采集及差异点分析 4
1.2.9 差异蛋白质质谱鉴定 4
2 结果与分析4
2.1供试材料双向电泳分析 4
2.2差异蛋白的质谱鉴定 5
2.3差异表达蛋白功能分类 5
3讨论6
3.1 信号转导相关蛋白 6
3.2能量代谢相关蛋白6
3.3蛋白合成相关蛋白6
3.4蛋白水解相关蛋白6
3.5 活性氧清除相关蛋白 7
致谢7
参考文献8
水稻中水杨酸缓解稻瘟病菌侵染相关蛋白的鉴定
引言
水稻是我国重要的粮食作物，由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是危害水稻最严重的“三大病害”之一，属世界性病害[1]。近年来，由于品种抗性、施肥水平、气候条件等因素的影响，稻瘟病的危害越来越严重。因此，如何防治和减少稻瘟病的发生，长期以来是我国粮食安全生产的主要任务之一[2]。实践证明，抗病品种的培育和种植是控制该病害最为经济、安全和有效的方法[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
34]。随着分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用，筛选与稻瘟病菌抗性相关的关键蛋白，是水稻抗病育种的一个重要工作，解决水稻抗病的分子机制这一复杂问题已渐露端倪[5]。
蛋白质组学研究着重于全面性和整体性，研究的对象是从整体水平上对蛋白质的表达和功能进行研究，包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因——核酸层次，深入到生命的直接执行者——蛋白质水平。蛋白质组研究已成为后基因组时代的主要任务[6]。目前，国内水稻抗稻瘟病蛋白质组学研究并不够深入，仅见张智慧等以抗稻瘟病水稻近等基因系为材料，应用差异蛋白质组学技术对外源茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的水稻叶片蛋白质差异表达变化进行了分析，结果鉴定了21个差异表达蛋白，并将这些蛋白功能分为8类，分别在植物抗性、氨基酸代谢、信号转导、光合作用、光呼吸、糖代谢、蛋白质合成与分解及细胞代谢等方面发挥作用[7]。
水杨酸( salicylic acid,SA)是植物体内的小分子物质, 具有多种重要的生理功能, 是一种新的植物激素, 并与植物的抗病性密切相关[89]。已有的研究结果表明, 水杨酸喷雾处理水稻后,可显著提高水稻对稻瘟病的抗性, 且水杨酸诱导水稻的幼苗体内与抗菌物质合成酶的活性密切相关[910]。鉴于此，笔者采用双向电泳、串联质谱等蛋白质组学技术，分析并鉴定了稻瘟病感病种质叶片经稻瘟病菌侵染后，喷施水杨酸前后的蛋白质差异，分析水杨酸相关差异蛋白的生物信息学功能，以期从蛋白质水平初步阐明水杨酸缓解稻瘟病菌侵染相关蛋白的作用过程和原理。
1 材料与方法
1．1 实验材料
稻瘟病敏感品种“日本晴”由大学农学院水稻所提供。稻瘟菌株（Guy11）由大学植物保护学院真菌学实验室提供。
1．2 实验方法
1．2．1 供试水稻的培养及稻瘟病菌侵染
选取200粒大小相近、颗粒饱满的稻瘟病敏感品种“日本晴”水稻种子，用70%酒精表面消毒后，浸泡在水中催芽。待其发芽，播种于浇有营养液的土盆中（每盆均匀播20粒，共9盆）。待水稻生长至二叶一心期，将9盆水稻随机分为3组（每组3盆）分别标记为CK、M、SA。对M组、SA组均匀喷施稻瘟病菌Guy11（菌浓度为5x104个/ml），再对SA组喷施水杨酸，CK组喷施水。水稻培养过程中，均放于温室中培养（温度：2527℃，光照时间：12h/d），每天中午查看水稻生长情况，及时浇水。待喷施后第7天时，同时取各组水稻叶片各3份，每份约1g，自封袋密封保存、做好标记，立即放入超低温冰箱中冷冻，待提取蛋白用。实验设三次重复。
1．2．2 水稻叶片蛋白提取
采用三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取水稻叶片总蛋白：
①洗净干燥的研钵中，加入适量PVP40，加液氮，放入水稻叶片（约1g），快速磨成粉末；
②将粉末转移至50ml的离心管中，加入30ml左右冷冻状态下的0.1%DTT、10%TCA/丙酮溶液，20℃沉淀2h，期间间歇摇匀；
③10000rpm，4℃，离心15min；
④弃去上清溶液，留下沉淀，加30ml冷丙酮，20℃沉淀1h；
⑤重复③④步骤，待沉淀为白色时即可；
⑥将沉淀37℃干燥成白色蛋白粉末，放于20℃冰箱保存，待用。
1．2．3 水稻叶片蛋白样品制备
取蛋白粉末约1mg，加入800μl左右裂解液，室温溶解。待白色粉末充分溶解， 10000rpm条件下，离心15min，取上清，待后续测定蛋白浓度。裂解液配方如下：
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