水稻幼苗对缺铁响应的蛋白组学研究
铁（Fe）是植物生长必要的微量元素，参与植物代谢的多种生理途径。为了研究水稻对缺铁环境的响应机理，本实验选用籼稻品种扬稻6号，采用了双向电泳技术（2-DE)和（MALDI-TOF-MS)质谱鉴定技术，研究了缺铁条件下，该品种叶片和根部的差异蛋白。试验共检测到73个差异表达蛋白，并成功鉴定出63个，其中40个在水稻叶片中，23个出现在根中。这些差异蛋白主要涉及光合，碳代谢，逆境抗氧化系统，三磷酸腺苷的合成，细胞生长或信号转导等生理代谢途径。
目录
摘 要1
关键词1
Abstract1
Key Words 1 引言1
1 材料与方法2
1.1 试验设计2
1.2 测试项目与方法2
1.2.1 蛋白质制备及定量2
1.2.2 等电聚焦和SDSPAGE3
1.2.3 蛋白点MALDITOFMS质谱技术分析3
1.2.4 鉴定目标蛋白质3
2 结果与分析3
2.1 水稻叶片和根系差异蛋白应对缺铁胁迫的变化3
2.2 差异蛋白点的作用分析3
2.3 叶片里差异蛋白点参与生理代谢途径分析3
2.3.1 碳代谢3
2.3.2 氮代谢4
2.3.3 信号转导4
2.3.4 蛋白质代谢4
2.3.5 逆境与防卫4
2.3.6 ATP合成5
2.4 水稻根里差异蛋白点参加生理代谢途径的分析5
2.4.1 碳代谢5
2.4.2 氨基酸代谢5
2.4.3 蛋白质代谢5
2.4.4 逆境与防御5
2.4.5 二级代谢6
2.4.6 细胞生长发育6
3 小结和讨论13
致谢15
参考文献16
水稻幼苗对缺铁响应的蛋白组学研究
引言
在WHO数据中，地球上约37亿人口缺铁，这其中将近20亿人患铁缺乏症。怀孕女性中约有50%的人出现缺铁性贫血症状，并且未怀孕女性里含有40%。地球上5岁以下儿童近31%出现微量元素缺
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
乏症状,主要体现的是缺铁[1]，并且微量元素缺乏症具有上升的走向，然而耕地面积随着人口的日益增多越来越少,所以作物含铁研究对人类营养非常重要。土壤中铁易受pH、磷酸根离子与氧化还原反应等多方面影响，常以稳定的不溶性Fe3+氧化物形式存在。植物铁吸收方式被划分为机理I(strategy I)和机理II(strategy II)两种。非禾本科单子叶植物与双子叶植物采取机理I(strategy I)的吸收机制以及高效活化从土壤里面吸收铁。禾本科植物主要使用机理Ⅱ吸收方式，也就是地下部分泌出铁载体，同时铁被螯合物吸收。根据研究可知，水稻也有机理I中的亚铁离子转运系统，也就是水稻可以直接通过亚铁离子转运系统从土壤中获取Fe2+和通过分泌PS螯合与获取Fe3+。由于水稻合成和分泌麦根酸类植物铁载体能力最弱，所以水稻容易有缺铁症状[2]。
水稻的正常生长发育会受过量逆境胁迫与养分缺乏影响，部分生理生态过程会发生变化，然而很多蛋白质类别与表达量也会随着这些变化而产生改变。因此研究与水稻适应缺铁胁迫有关的蛋白质组，并发现当中有关的重要蛋白质，来阐述缺铁环境下水稻应对其的分子机理，这是非常必要的。
蛋白质组（proteome）学来自于基因组（genome）以及蛋白质（protein）这两个词的联合，作为功能基因组学中的重要研究方法之一，其意为一种基因组表达的所有蛋白质，也就是包含一种生物以及一种细胞所表达的所有蛋白质[3]。蛋白质组学研究的关键技术主要包含蛋白质分离技术、鉴定技术和支持质谱数据的蛋白匹配数据库。其技术线路流程是：（1）取蛋白样品；（2）电泳分离；（3）采集图像分析（4）蛋白点的提取纯化（5）质谱MALDITOFMS 分析（6）获得肽质量指纹（PMF）（7）数据库中搜索质谱数据（8）蛋白质相关功能[4]。双向凝胶电泳（Twodimensional PAGE，简称 2DE）是目前分离纯化蛋白质最经典有效的技术。这个技术通过蛋白质分子量大小以及带电性的差别，利用两遍凝胶电泳来将蛋白质群分离的技术。蛋白质鉴定技术为蛋白质组学中重要技术之一。现在进行蛋白质鉴定的关键技术是质谱技术（Mass Spectrometry），即分子离子化蛋白质样品，再通过质荷比分离并确定其分子量。蛋白质高通量的鉴定研究可以通过质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）软电离技术提高。这个技术为现在最为有用的蛋白质分离鉴定技术，步骤为分离蛋白质混合物，第一向强阳离子与其交换，第二向通过使用反向色谱，再使用质谱鉴定，互补独立于通常的2DE途径[5]。
差异蛋白质组学为蛋白质组学采用的普遍策略之一，旨在于筛选与鉴定在不同状态中各样本间表达特异的蛋白质，以及获取它们的功能，以研究出生物机体应对外界环境变化而产生反应的机制。差异蛋白质组学研究主要有三大技术:（1）生物信息学技术;（2）质谱分析技术;（3)双向电泳技术。找寻到关键差异蛋白是差异蛋白质组学的研究重心，不需要获取所有蛋白，所以其现在这项技术有着广泛的前景与美好的可实现性［6］。差异蛋白组质组学研究对于水稻适应缺铁环境和应对缺铁胁迫有着重要作用，它可以使得人们更好的探究并知晓水稻对缺铁胁迫的防御机制与适应机制。
近年来，作物中铁营养方面的研究稍有进展，但在缺铁时蛋白组学响应这一块仍然不足。大部分蛋白质组学研究主要是针对机理I植物，机理II植物也只是在玉米方向稍有研究[7]，并且很少针对性的研究与机理I植物叶片与根部相关的蛋白质组学，所以针对性研究水稻幼苗对缺铁的响应尤其有必要。本实验选用扬稻6号，并用双向电泳和串联质谱技术检测了水稻叶片和根系蛋白质组对缺铁的响应，可以为未来水稻铁营养高效吸收、转运和储藏等机制研究以及水稻营养高效的分子设计育种等研究提供有力依据
1 材料与方法
1.1 试验设计
选用常规品种（扬稻6号）作为试验材料，于2015年、2016年在大学网室进行试验，设立了3个独立重复试验。催芽种子后播于孔径适宜且已固定好的泡沫板上，在水培箱（6L）中培养，在光照充足且便于通风的条件下培养，培养液的配方：10 mg L1 NaH2PO4?2H2O、40 mg L1 MgSO4?7H2O、40 mg L1 CaCl2、40 mg L1 K2SO4、0.5 mg L1 MnCl2?4H2O、0.05 mg L1 (NH4)6?Mo7O24?2H2O、0.2 mg L1 H3BO3、0.01 mg L1 CuSO4?5H2O、0.01 mg L1 ZnSO4?7H2O和5.8 mg L1 FeCl3，以NH4NO3调节培养液氮浓度，借鉴于国际水稻研究所常规配方[7] 。在幼苗2叶1心期前使用1/2浓度营养液培养一周，接下来两周用完全营养液培养，每周换一次营养液。
培养三周后，对试验材料进行缺铁处理，其他营养配方保持不变，仅分为不供铁和正常供铁。每日用1 mol L1 HCl调节溶液pH到5.0± 0.2，并且每个处理重复3遍，两日换一次处理营养液。处理两周后，速冻完全展开叶和根系于液氮，置82°中保存备用。1.2 测试项目与方法
目录
摘 要1
关键词1
Abstract1
Key Words 1 引言1
1 材料与方法2
1.1 试验设计2
1.2 测试项目与方法2
1.2.1 蛋白质制备及定量2
1.2.2 等电聚焦和SDSPAGE3
1.2.3 蛋白点MALDITOFMS质谱技术分析3
1.2.4 鉴定目标蛋白质3
2 结果与分析3
2.1 水稻叶片和根系差异蛋白应对缺铁胁迫的变化3
2.2 差异蛋白点的作用分析3
2.3 叶片里差异蛋白点参与生理代谢途径分析3
2.3.1 碳代谢3
2.3.2 氮代谢4
2.3.3 信号转导4
2.3.4 蛋白质代谢4
2.3.5 逆境与防卫4
2.3.6 ATP合成5
2.4 水稻根里差异蛋白点参加生理代谢途径的分析5
2.4.1 碳代谢5
2.4.2 氨基酸代谢5
2.4.3 蛋白质代谢5
2.4.4 逆境与防御5
2.4.5 二级代谢6
2.4.6 细胞生长发育6
3 小结和讨论13
致谢15
参考文献16
水稻幼苗对缺铁响应的蛋白组学研究
引言
在WHO数据中，地球上约37亿人口缺铁，这其中将近20亿人患铁缺乏症。怀孕女性中约有50%的人出现缺铁性贫血症状，并且未怀孕女性里含有40%。地球上5岁以下儿童近31%出现微量元素缺
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
乏症状,主要体现的是缺铁[1]，并且微量元素缺乏症具有上升的走向，然而耕地面积随着人口的日益增多越来越少,所以作物含铁研究对人类营养非常重要。土壤中铁易受pH、磷酸根离子与氧化还原反应等多方面影响，常以稳定的不溶性Fe3+氧化物形式存在。植物铁吸收方式被划分为机理I(strategy I)和机理II(strategy II)两种。非禾本科单子叶植物与双子叶植物采取机理I(strategy I)的吸收机制以及高效活化从土壤里面吸收铁。禾本科植物主要使用机理Ⅱ吸收方式，也就是地下部分泌出铁载体，同时铁被螯合物吸收。根据研究可知，水稻也有机理I中的亚铁离子转运系统，也就是水稻可以直接通过亚铁离子转运系统从土壤中获取Fe2+和通过分泌PS螯合与获取Fe3+。由于水稻合成和分泌麦根酸类植物铁载体能力最弱，所以水稻容易有缺铁症状[2]。
水稻的正常生长发育会受过量逆境胁迫与养分缺乏影响，部分生理生态过程会发生变化，然而很多蛋白质类别与表达量也会随着这些变化而产生改变。因此研究与水稻适应缺铁胁迫有关的蛋白质组，并发现当中有关的重要蛋白质，来阐述缺铁环境下水稻应对其的分子机理，这是非常必要的。
蛋白质组（proteome）学来自于基因组（genome）以及蛋白质（protein）这两个词的联合，作为功能基因组学中的重要研究方法之一，其意为一种基因组表达的所有蛋白质，也就是包含一种生物以及一种细胞所表达的所有蛋白质[3]。蛋白质组学研究的关键技术主要包含蛋白质分离技术、鉴定技术和支持质谱数据的蛋白匹配数据库。其技术线路流程是：（1）取蛋白样品；（2）电泳分离；（3）采集图像分析（4）蛋白点的提取纯化（5）质谱MALDITOFMS 分析（6）获得肽质量指纹（PMF）（7）数据库中搜索质谱数据（8）蛋白质相关功能[4]。双向凝胶电泳（Twodimensional PAGE，简称 2DE）是目前分离纯化蛋白质最经典有效的技术。这个技术通过蛋白质分子量大小以及带电性的差别，利用两遍凝胶电泳来将蛋白质群分离的技术。蛋白质鉴定技术为蛋白质组学中重要技术之一。现在进行蛋白质鉴定的关键技术是质谱技术（Mass Spectrometry），即分子离子化蛋白质样品，再通过质荷比分离并确定其分子量。蛋白质高通量的鉴定研究可以通过质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）软电离技术提高。这个技术为现在最为有用的蛋白质分离鉴定技术，步骤为分离蛋白质混合物，第一向强阳离子与其交换，第二向通过使用反向色谱，再使用质谱鉴定，互补独立于通常的2DE途径[5]。
差异蛋白质组学为蛋白质组学采用的普遍策略之一，旨在于筛选与鉴定在不同状态中各样本间表达特异的蛋白质，以及获取它们的功能，以研究出生物机体应对外界环境变化而产生反应的机制。差异蛋白质组学研究主要有三大技术:（1）生物信息学技术;（2）质谱分析技术;（3)双向电泳技术。找寻到关键差异蛋白是差异蛋白质组学的研究重心，不需要获取所有蛋白，所以其现在这项技术有着广泛的前景与美好的可实现性［6］。差异蛋白组质组学研究对于水稻适应缺铁环境和应对缺铁胁迫有着重要作用，它可以使得人们更好的探究并知晓水稻对缺铁胁迫的防御机制与适应机制。
近年来，作物中铁营养方面的研究稍有进展，但在缺铁时蛋白组学响应这一块仍然不足。大部分蛋白质组学研究主要是针对机理I植物，机理II植物也只是在玉米方向稍有研究[7]，并且很少针对性的研究与机理I植物叶片与根部相关的蛋白质组学，所以针对性研究水稻幼苗对缺铁的响应尤其有必要。本实验选用扬稻6号，并用双向电泳和串联质谱技术检测了水稻叶片和根系蛋白质组对缺铁的响应，可以为未来水稻铁营养高效吸收、转运和储藏等机制研究以及水稻营养高效的分子设计育种等研究提供有力依据
1 材料与方法
1.1 试验设计
选用常规品种（扬稻6号）作为试验材料，于2015年、2016年在大学网室进行试验，设立了3个独立重复试验。催芽种子后播于孔径适宜且已固定好的泡沫板上，在水培箱（6L）中培养，在光照充足且便于通风的条件下培养，培养液的配方：10 mg L1 NaH2PO4?2H2O、40 mg L1 MgSO4?7H2O、40 mg L1 CaCl2、40 mg L1 K2SO4、0.5 mg L1 MnCl2?4H2O、0.05 mg L1 (NH4)6?Mo7O24?2H2O、0.2 mg L1 H3BO3、0.01 mg L1 CuSO4?5H2O、0.01 mg L1 ZnSO4?7H2O和5.8 mg L1 FeCl3，以NH4NO3调节培养液氮浓度，借鉴于国际水稻研究所常规配方[7] 。在幼苗2叶1心期前使用1/2浓度营养液培养一周，接下来两周用完全营养液培养，每周换一次营养液。
培养三周后，对试验材料进行缺铁处理，其他营养配方保持不变，仅分为不供铁和正常供铁。每日用1 mol L1 HCl调节溶液pH到5.0± 0.2，并且每个处理重复3遍，两日换一次处理营养液。处理两周后，速冻完全展开叶和根系于液氮，置82°中保存备用。1.2 测试项目与方法
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