对硫磷吡虫啉双标记时间分辨荧光免疫分析方法研究
本论文利用对硫磷、吡虫啉荧光标记抗体建立了对硫磷、吡虫啉双标记时间分辨荧光免疫分析方法。结果表明，在最优条件下，对硫磷的IC50值为10.87μg/L，最低检测限(IC10)为0.0248μg/L，吡虫啉的IC50值为7.077μg/L，最低检测限为0.0276μg/L。在田水、土壤、大米、甘蓝和西红柿五种基质中对硫磷平均添加回收率为81.54-110.9%，吡虫啉平均添加回收率为78.9-104.2%；相对标准偏差分别为3.23-10.5%和2.44-11.6%。在真实样品检测中，建立的双标记TRFIA方法的检测结果与GC具有高度一致性，但是双标记TRFIA在灵敏度和前处理方面均优于GC。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
材料与方法3
1.1实验材料3
1.1.1实验仪器3
1.1.2实验试剂3
1.2 实验方法4
1.2.1 标记物的制备与纯化4
1.2.2 dualTRFIA的建立4
1.2.3 分析条件优化4
1.2.4标准曲线的建立5
1.2.5交叉反应率的测定5
1.2.6 添加回收率的测定 5
1.2.7 基质影响的评价 5
1.2.8 真实样品检测 5
2 结果与分析 6
2.1 TRFIA的条件优化6
2.1.1 TRFIA的工作浓度 6
2.1.2甲醇含量的影响 6
2.1.3 Na+浓度的影响7
2.1.4 pH值的影响 7
2.2 标准曲线的建立 8
2.3特异性分析 9
2.4基质影响10
2.5添加回收率与方法的精密度12
2.6相关性验证12
3 讨论 13
3.1方法优化条件分析 13
3.2方法的特异性分析 13
3.3方法的准确性分析14
致谢14
参考文献15
对硫磷、吡 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
虫啉双标记时间分辨
荧光免疫分析方法研究
引言
引言
吡虫啉(Imidacloprid)是新型氯化烟碱类杀虫剂中的代表品种，由于其杀虫活性、光稳定性、低毒性、广泛使用性等方面的优势，在硝基亚胺类化合物中脱颖而出，受到农药研究人员的广泛关注。近年来，由于其杀虫谱广，在国内外的销量快速增长[1]，在美国甚至还被用于社区、运动场、高尔夫球场等的草坪害虫防控[2]。虽然吡虫啉属低毒农药，但由于其与人类，环境接触频繁，不免对人体健康，生态环境等造成严重影响。目前国内外已制订出多种农产品中吡虫啉的最大残留限量标准，其残留检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、电化学分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)[3]。对硫磷(Parathion)是一种具有触杀、胃毒、熏蒸及部分杀卵作用的有机磷类广谱杀虫、杀螨剂，可有效防治水稻、棉花、玉米上的多种害虫和地下害虫，在日常的使用过程中，对硫磷可通过食道、呼吸道和皮肤引起人体的中毒反应[4]。此外，对硫磷属高毒农药，其氧化后毒性还可增加[5]，所以对其农药残留的检测显得尤为重要。目前国内外对对硫磷等有机磷类农药残留检测分为活体生物检测、理化分析、酶抑制法和免疫分析法四种。活体生物检测方法粗放，研究较少。而运用农药仪器分析的比色法、紫外和红外光谱分析法、荧光光谱法、气相色谱(GC)、气谱/质谱(GC/S)和高效液相色谱(HPLC)法等是目前主要检测方法，但其前处理过程繁琐,分析速度慢、成本高，对检测人员要求高，难以适应大量复杂样品和现场快速检测的要求。早在1993年刘长武[6]等就以对硫磷为样药，梨和苹果为试材开发其酶联免疫分析方法，梨、苹果样品中对硫磷的最低检测浓度分别为0.15ppm和0.225ppm，添加回收率均高于88%。酶抑制法测定有机磷农药虽快速,简便,经济,易于操作,但不能确定测定出的是哪种农药,而且灵敏度差,与国际上日益严格的农药最高残留限量相比仍然显得粗放。而本文采用的免疫化学分析方法由于具有相对较高的特异性和灵敏度,可以有效避免复杂样本中杂质的干扰,大大简化前处理净化步骤,正逐步得到人们的认可[7]。
通常免疫分析被用于特异性检测单个分析物，但是其也可以用于检测多个分析物，这种分析方法被称为多残留免疫分析。多残留免疫分析一般通过多种特异性抗体同时使用或利用制备“宽谱”抗体的方法来实现。多种特异性抗体同时使用的方法首先需要制备多种待测农药的特异性抗体，再同时使用这些抗体测定多种农药。Skerritt等[8]分别制备了杀螟硫磷、甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷的特异性抗体，再将三种抗体包被在同一块酶标板的不同微孔中，然后加入对应的酶标半抗原和谷物提取液，采用直接竞争ELISA法测定三种农药的残留量。吴雅欣[9]将毒死蜱、甲胺磷的包被抗原混合后包被在同一个微孔中，设计多种抗原抗体不同比例的组合，采用间接竞争ELISA法在同一酶标板检测两种农药单残留和两种农药多残留总量。“宽谱”抗体可以通过设计合成“通用”半抗原，制备“多簇”抗原和制备“双特异性”单克隆抗体等方法获得。通常同一类农药存在“共性结构”，利用抗体对类似结构化合物具有交叉反应的原理，设计合成含有“共性结构”的半抗原，即可制备能同时识别几种农药或一类农药的“宽谱”抗体，从而建立多残留免疫分析方法。该方法是目前实现农药多残留免疫快速检测的主要方式。Liu[10]等通过合成具有芳环有机磷农药共性结构的半抗原，建立该类农药的多残留免疫分析方法，测得杀螟硫磷、毒死蜱、甲基立枯磷、倍硫磷、马拉硫磷、对硫磷的IC50值分别为3540、810、1100、1210、10470、580μg/L，交叉反应率分别为100%、437%、322%、293%、34%、610%。Xu等[11]根据乙氧基有机磷农药的结构特点，以O，O二乙基O对苯甲酸硫代磷酸酯为半抗原获得的多克隆抗体对对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、甲拌磷、除线磷、辛硫磷均能识别，交叉反应率分别为100%、2975%、1700%、1081%、41.3%、44.1%、27.3%。此外研究者也对通过制备“多簇”抗原来获得“宽谱”抗体进行了尝试，王姝婷[12]尝试将甲基对硫磷、毒死蜱、三唑磷和克百威的免疫抗原1:1:1:1混合后，免疫大白兔制备“宽谱”抗体，抗体对四种农药均有效价，但没有明显的抑制反应。王姝婷同时将四种有机磷农药的半抗原依次偶联到BSA载体上制备“多簇”免疫抗原（两种及以上的半抗原与BSA偶联制备的人工抗原），免疫大白兔制备的“宽谱”多克隆抗体能同时识别甲基对硫磷、毒死蜱、三唑磷和克百威，IC50值分别为2824、582、65和290μg/L。双特异性单克隆抗体（bispecific monoclonal antibody，BsAb）是通过化学偶联、双杂交瘤技术或基因工程法制备的一种单克隆抗体的特殊类型。该技术在医学诊断领域应用较多，但在农药残留检测方面报道较少，仅有李刚[13]，金仁耀[14]等研究者做过相关研究。
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摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
材料与方法3
1.1实验材料3
1.1.1实验仪器3
1.1.2实验试剂3
1.2 实验方法4
1.2.1 标记物的制备与纯化4
1.2.2 dualTRFIA的建立4
1.2.3 分析条件优化4
1.2.4标准曲线的建立5
1.2.5交叉反应率的测定5
1.2.6 添加回收率的测定 5
1.2.7 基质影响的评价 5
1.2.8 真实样品检测 5
2 结果与分析 6
2.1 TRFIA的条件优化6
2.1.1 TRFIA的工作浓度 6
2.1.2甲醇含量的影响 6
2.1.3 Na+浓度的影响7
2.1.4 pH值的影响 7
2.2 标准曲线的建立 8
2.3特异性分析 9
2.4基质影响10
2.5添加回收率与方法的精密度12
2.6相关性验证12
3 讨论 13
3.1方法优化条件分析 13
3.2方法的特异性分析 13
3.3方法的准确性分析14
致谢14
参考文献15
对硫磷、吡 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
虫啉双标记时间分辨
荧光免疫分析方法研究
引言
引言
吡虫啉(Imidacloprid)是新型氯化烟碱类杀虫剂中的代表品种，由于其杀虫活性、光稳定性、低毒性、广泛使用性等方面的优势，在硝基亚胺类化合物中脱颖而出，受到农药研究人员的广泛关注。近年来，由于其杀虫谱广，在国内外的销量快速增长[1]，在美国甚至还被用于社区、运动场、高尔夫球场等的草坪害虫防控[2]。虽然吡虫啉属低毒农药，但由于其与人类，环境接触频繁，不免对人体健康，生态环境等造成严重影响。目前国内外已制订出多种农产品中吡虫啉的最大残留限量标准，其残留检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、电化学分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)[3]。对硫磷(Parathion)是一种具有触杀、胃毒、熏蒸及部分杀卵作用的有机磷类广谱杀虫、杀螨剂，可有效防治水稻、棉花、玉米上的多种害虫和地下害虫，在日常的使用过程中，对硫磷可通过食道、呼吸道和皮肤引起人体的中毒反应[4]。此外，对硫磷属高毒农药，其氧化后毒性还可增加[5]，所以对其农药残留的检测显得尤为重要。目前国内外对对硫磷等有机磷类农药残留检测分为活体生物检测、理化分析、酶抑制法和免疫分析法四种。活体生物检测方法粗放，研究较少。而运用农药仪器分析的比色法、紫外和红外光谱分析法、荧光光谱法、气相色谱(GC)、气谱/质谱(GC/S)和高效液相色谱(HPLC)法等是目前主要检测方法，但其前处理过程繁琐,分析速度慢、成本高，对检测人员要求高，难以适应大量复杂样品和现场快速检测的要求。早在1993年刘长武[6]等就以对硫磷为样药，梨和苹果为试材开发其酶联免疫分析方法，梨、苹果样品中对硫磷的最低检测浓度分别为0.15ppm和0.225ppm，添加回收率均高于88%。酶抑制法测定有机磷农药虽快速,简便,经济,易于操作,但不能确定测定出的是哪种农药,而且灵敏度差,与国际上日益严格的农药最高残留限量相比仍然显得粗放。而本文采用的免疫化学分析方法由于具有相对较高的特异性和灵敏度,可以有效避免复杂样本中杂质的干扰,大大简化前处理净化步骤,正逐步得到人们的认可[7]。
通常免疫分析被用于特异性检测单个分析物，但是其也可以用于检测多个分析物，这种分析方法被称为多残留免疫分析。多残留免疫分析一般通过多种特异性抗体同时使用或利用制备“宽谱”抗体的方法来实现。多种特异性抗体同时使用的方法首先需要制备多种待测农药的特异性抗体，再同时使用这些抗体测定多种农药。Skerritt等[8]分别制备了杀螟硫磷、甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷的特异性抗体，再将三种抗体包被在同一块酶标板的不同微孔中，然后加入对应的酶标半抗原和谷物提取液，采用直接竞争ELISA法测定三种农药的残留量。吴雅欣[9]将毒死蜱、甲胺磷的包被抗原混合后包被在同一个微孔中，设计多种抗原抗体不同比例的组合，采用间接竞争ELISA法在同一酶标板检测两种农药单残留和两种农药多残留总量。“宽谱”抗体可以通过设计合成“通用”半抗原，制备“多簇”抗原和制备“双特异性”单克隆抗体等方法获得。通常同一类农药存在“共性结构”，利用抗体对类似结构化合物具有交叉反应的原理，设计合成含有“共性结构”的半抗原，即可制备能同时识别几种农药或一类农药的“宽谱”抗体，从而建立多残留免疫分析方法。该方法是目前实现农药多残留免疫快速检测的主要方式。Liu[10]等通过合成具有芳环有机磷农药共性结构的半抗原，建立该类农药的多残留免疫分析方法，测得杀螟硫磷、毒死蜱、甲基立枯磷、倍硫磷、马拉硫磷、对硫磷的IC50值分别为3540、810、1100、1210、10470、580μg/L，交叉反应率分别为100%、437%、322%、293%、34%、610%。Xu等[11]根据乙氧基有机磷农药的结构特点，以O，O二乙基O对苯甲酸硫代磷酸酯为半抗原获得的多克隆抗体对对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、甲拌磷、除线磷、辛硫磷均能识别，交叉反应率分别为100%、2975%、1700%、1081%、41.3%、44.1%、27.3%。此外研究者也对通过制备“多簇”抗原来获得“宽谱”抗体进行了尝试，王姝婷[12]尝试将甲基对硫磷、毒死蜱、三唑磷和克百威的免疫抗原1:1:1:1混合后，免疫大白兔制备“宽谱”抗体，抗体对四种农药均有效价，但没有明显的抑制反应。王姝婷同时将四种有机磷农药的半抗原依次偶联到BSA载体上制备“多簇”免疫抗原（两种及以上的半抗原与BSA偶联制备的人工抗原），免疫大白兔制备的“宽谱”多克隆抗体能同时识别甲基对硫磷、毒死蜱、三唑磷和克百威，IC50值分别为2824、582、65和290μg/L。双特异性单克隆抗体（bispecific monoclonal antibody，BsAb）是通过化学偶联、双杂交瘤技术或基因工程法制备的一种单克隆抗体的特殊类型。该技术在医学诊断领域应用较多，但在农药残留检测方面报道较少，仅有李刚[13]，金仁耀[14]等研究者做过相关研究。
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