黄连不同提取部位的制备及其对致腐菌的抑制作用比较
目 录
1 引言 1
1.1 药用植物粗提物抑菌活性的研究 1
1.2 溶剂提取法 1
1.3 常用的抑菌实验方法 2
1.4 实验研究内容与目的 3
2 实验材料与方法 3
2.1 实验试剂，仪器和样品 3
2.2 提取工艺 3
2.3 提取工艺的优化 5
2.4 最佳工艺的验证实验 7
2.5 黄连不同提取部位的抑菌实验 8
3 实验结果与分析 10
3.1 石油醚提取结果分析 10
3.2 三氯甲烷提取结果分析 13
3.3 正丁醇提取结果分析 17
3.4 无水乙醇提取结果分析 20
3.5 纯水提取结果分析 24
3.6 抑菌实验结果分析 27
结论 28
致 谢 29
参 考 文 献 30
1 引言
国内外对黄连化学成分、药理作用、制备工艺、临床应用等的研究进展，并从多个黄连是毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch、三角叶黄连Coptis deltoidenC.Y.Cheng etHsiao.或云连Coptis teetawall.的干燥根茎。三者分别习称味连、雅连、云连。为著名常用中药，在方剂中的应用频率非常高。黄连苦、寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒的功效。近年来研究者在黄连的成分、药理等方面进行了深入的研究，已取得一些新的研究成果。本文综述了近年来国角度进行了探讨。
致腐菌是诱发果蔬采摘后腐烂，造成果蔬在贮运期间腐败变质的主要原因。在我国，由于缺乏必要的冷贮设备[1] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，果蔬采后病害的防治主要采用杀菌剂，尤其是化学杀菌剂。用化学杀菌剂会对人体健康及环境造成危害，同时使水果致腐菌产生抗药性[2]，进一步加剧果蔬腐烂，因此迫切需要寻找一种有效而对人类无害的杀菌剂取代传统的化学杀菌剂[3]。近年来采用中药源绿色杀菌剂替代化学杀菌剂成为了果蔬防腐行业发展的必然趋势，筛选抗菌中药并将其开发为防腐剂既然是中药二次开发的策略之一，又是果蔬防腐行业的热点。黄连为毛茛科植物黄连干燥根茎。研究表明黄连对球菌和杆菌具有非常显著的抑菌作用，为此，本实验拟探讨黄连对致腐菌的抑制作用研究，并寻找最佳提取部位，为开发黄连抑菌保鲜剂提供参考。
1.1 药用植物粗提物抑菌活性的研究
植物源杀菌剂是一类利用植物中含有杀菌活性物质的某些部分或提取有效成分制成的杀菌剂，具有高效、低毒或无毒、无污染、选择性高，不易产生抗药性等优点[4]。中国有丰富的药用植物资源，这是开发植物源农药的理想来源[5]。尽管药用植物在中国医学领域的药用价值被人们认可已有千年之久，而在植物病虫害防治的应用上还是最近几十年才开始深入研究。孙海峰[6]研究表明药用植物川楝子、知母有较强的抑菌作用。Lee[7]发现肉桂的丙酮提取物对番茄的灰霉病菌表现较强的抑菌活性。吴新安[8]试验发现蛇床子、虎杖等对苹果炭疽病有很好抑制作用。王筠默[9]、吕霞[10]报道药用植物黄连的抑菌谱较广。Eberhard[11]报道黄连中的小檗碱对马铃薯晚疫病病原真菌具有抑菌活性。
1.2 溶剂提取法
溶剂提取法[12]根据“相似者相溶”的原理，通过选择适当溶剂将化学成分从原料中提取出来。其常见的方法有：浸渍法、连续提取法[13]、超声波提取[14]。其中浸渍法是在常温或低温（<80℃)条件下用适当的溶剂浸渍药材以溶出其中成分的方法，该方法适用于有效成分不稳定的或大量淀粉、树胶、果胶、粘液质的药材提取。回流提取法[15]：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器，瓶内装药材约为容量的2/3，溶剂浸过药材表面约1～2 cm。超声提取法是采用超声波辅助提取溶剂进行提取的方法，超声波作用液体介质引起介质的振动，当振动处于稀疏状态时，在介质中形成许多小空穴，这些小空穴的瞬间闭合，造成空化现象，它可造成植物细胞及整个生物体的瞬间破裂是溶液能渗透到药材的细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解于溶剂，该方法不会改变有效成分的结构，同时缩短了提取时间，提高了提取率。
1.3 常用的抑菌实验方法
1.3.1 滤纸片药液浸泡法
滤纸片药液浸泡法[16,17,18]是在超净工作台上，将灭菌滤纸片用无菌镊子放入到含药液的灭菌培养皿中浸泡。用无菌镊子以无菌操作夹取含药纸片，将多余药液在内培养皿边上擦掉，贴在含菌平板培养基表面，轻轻按压，使药片与培养基密切接触。滤纸片距培养皿边缘15 mm，每个培养皿均匀放置5张药片，用泡过灭菌生理盐水滤纸片做对照。每种药片涂布法做3个重复，完成后将培养皿放在37℃恒温培养箱，培养24 h，观察、测量、记录。
1.3.2 牛津杯法
牛津杯法[19-20]是将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，再垂直放置于培养基表面，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙。每个平板放置5个牛津杯，每个牛津杯注入200 μL药液，中间的用生理盐水作对照。药液不可溢出来，每种药液涂布法做3个重复，培养24 h，观察，测量、记录。
1.4 实验研究内容与目的
实验采用溶剂提取法，用不同溶剂对黄连中活性成分进行提取，通过单因素提取讨论不同料液比、提取次数、提取时间条件下对黄连提取物干膏率的影响，并采取正交提取实验筛选最佳提取方法，采用牛津杯法研究黄连不同溶剂提取物对致腐菌的抑制效果，本实验通过研究黄连的不同部位提取物对致腐菌的抑制作用，从而筛选出黄连提取的最佳提取部位。
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂，仪器和样品
2.1.1 药材与试剂
实验试剂，见表1。
表1 实验所需材料与试剂
名称 规格 生产厂家
黄连 重庆
石油醚 AR 上海久亿化学试剂有限公司
三氯甲烷 AR 南京奥佳化工有限公司
正丁醇 AR 上海久亿化学试剂有限公司
无水乙醇 AR 上海久亿化学试剂有限公司
二甲亚砜 AR 国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉 AR 天津市恒兴化学试剂制造有限公司
蔗糖 CP 上海久亿化学试剂有限公司
2.1.2 实验仪器设备
称取一定量的黄连粗粉(m)，称量干燥后的黄连干膏的质量(m1)。
计算公式：
提取率 （1）
式中：m1：干燥后的白头翁干膏的质量，g
m：白头翁粗粉的质量，g
2.2.1 石油醚组分提取工艺
称取黄连细粉（过60目筛）100 g于2000 mL的三口烧瓶中，加入适量溶剂后，60℃水浴加热一定时间、一定次数，提取液经离心或抽滤得滤液和滤渣，滤渣烘干后用于下个溶剂提取，滤液经浓缩烘干后得黄连石油醚干膏。
1 引言 1
1.1 药用植物粗提物抑菌活性的研究 1
1.2 溶剂提取法 1
1.3 常用的抑菌实验方法 2
1.4 实验研究内容与目的 3
2 实验材料与方法 3
2.1 实验试剂，仪器和样品 3
2.2 提取工艺 3
2.3 提取工艺的优化 5
2.4 最佳工艺的验证实验 7
2.5 黄连不同提取部位的抑菌实验 8
3 实验结果与分析 10
3.1 石油醚提取结果分析 10
3.2 三氯甲烷提取结果分析 13
3.3 正丁醇提取结果分析 17
3.4 无水乙醇提取结果分析 20
3.5 纯水提取结果分析 24
3.6 抑菌实验结果分析 27
结论 28
致 谢 29
参 考 文 献 30
1 引言
国内外对黄连化学成分、药理作用、制备工艺、临床应用等的研究进展，并从多个黄连是毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch、三角叶黄连Coptis deltoidenC.Y.Cheng etHsiao.或云连Coptis teetawall.的干燥根茎。三者分别习称味连、雅连、云连。为著名常用中药，在方剂中的应用频率非常高。黄连苦、寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒的功效。近年来研究者在黄连的成分、药理等方面进行了深入的研究，已取得一些新的研究成果。本文综述了近年来国角度进行了探讨。
致腐菌是诱发果蔬采摘后腐烂，造成果蔬在贮运期间腐败变质的主要原因。在我国，由于缺乏必要的冷贮设备[1] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，果蔬采后病害的防治主要采用杀菌剂，尤其是化学杀菌剂。用化学杀菌剂会对人体健康及环境造成危害，同时使水果致腐菌产生抗药性[2]，进一步加剧果蔬腐烂，因此迫切需要寻找一种有效而对人类无害的杀菌剂取代传统的化学杀菌剂[3]。近年来采用中药源绿色杀菌剂替代化学杀菌剂成为了果蔬防腐行业发展的必然趋势，筛选抗菌中药并将其开发为防腐剂既然是中药二次开发的策略之一，又是果蔬防腐行业的热点。黄连为毛茛科植物黄连干燥根茎。研究表明黄连对球菌和杆菌具有非常显著的抑菌作用，为此，本实验拟探讨黄连对致腐菌的抑制作用研究，并寻找最佳提取部位，为开发黄连抑菌保鲜剂提供参考。
1.1 药用植物粗提物抑菌活性的研究
植物源杀菌剂是一类利用植物中含有杀菌活性物质的某些部分或提取有效成分制成的杀菌剂，具有高效、低毒或无毒、无污染、选择性高，不易产生抗药性等优点[4]。中国有丰富的药用植物资源，这是开发植物源农药的理想来源[5]。尽管药用植物在中国医学领域的药用价值被人们认可已有千年之久，而在植物病虫害防治的应用上还是最近几十年才开始深入研究。孙海峰[6]研究表明药用植物川楝子、知母有较强的抑菌作用。Lee[7]发现肉桂的丙酮提取物对番茄的灰霉病菌表现较强的抑菌活性。吴新安[8]试验发现蛇床子、虎杖等对苹果炭疽病有很好抑制作用。王筠默[9]、吕霞[10]报道药用植物黄连的抑菌谱较广。Eberhard[11]报道黄连中的小檗碱对马铃薯晚疫病病原真菌具有抑菌活性。
1.2 溶剂提取法
溶剂提取法[12]根据“相似者相溶”的原理，通过选择适当溶剂将化学成分从原料中提取出来。其常见的方法有：浸渍法、连续提取法[13]、超声波提取[14]。其中浸渍法是在常温或低温（<80℃)条件下用适当的溶剂浸渍药材以溶出其中成分的方法，该方法适用于有效成分不稳定的或大量淀粉、树胶、果胶、粘液质的药材提取。回流提取法[15]：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器，瓶内装药材约为容量的2/3，溶剂浸过药材表面约1～2 cm。超声提取法是采用超声波辅助提取溶剂进行提取的方法，超声波作用液体介质引起介质的振动，当振动处于稀疏状态时，在介质中形成许多小空穴，这些小空穴的瞬间闭合，造成空化现象，它可造成植物细胞及整个生物体的瞬间破裂是溶液能渗透到药材的细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解于溶剂，该方法不会改变有效成分的结构，同时缩短了提取时间，提高了提取率。
1.3 常用的抑菌实验方法
1.3.1 滤纸片药液浸泡法
滤纸片药液浸泡法[16,17,18]是在超净工作台上，将灭菌滤纸片用无菌镊子放入到含药液的灭菌培养皿中浸泡。用无菌镊子以无菌操作夹取含药纸片，将多余药液在内培养皿边上擦掉，贴在含菌平板培养基表面，轻轻按压，使药片与培养基密切接触。滤纸片距培养皿边缘15 mm，每个培养皿均匀放置5张药片，用泡过灭菌生理盐水滤纸片做对照。每种药片涂布法做3个重复，完成后将培养皿放在37℃恒温培养箱，培养24 h，观察、测量、记录。
1.3.2 牛津杯法
牛津杯法[19-20]是将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，再垂直放置于培养基表面，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙。每个平板放置5个牛津杯，每个牛津杯注入200 μL药液，中间的用生理盐水作对照。药液不可溢出来，每种药液涂布法做3个重复，培养24 h，观察，测量、记录。
1.4 实验研究内容与目的
实验采用溶剂提取法，用不同溶剂对黄连中活性成分进行提取，通过单因素提取讨论不同料液比、提取次数、提取时间条件下对黄连提取物干膏率的影响，并采取正交提取实验筛选最佳提取方法，采用牛津杯法研究黄连不同溶剂提取物对致腐菌的抑制效果，本实验通过研究黄连的不同部位提取物对致腐菌的抑制作用，从而筛选出黄连提取的最佳提取部位。
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂，仪器和样品
2.1.1 药材与试剂
实验试剂，见表1。
表1 实验所需材料与试剂
名称 规格 生产厂家
黄连 重庆
石油醚 AR 上海久亿化学试剂有限公司
三氯甲烷 AR 南京奥佳化工有限公司
正丁醇 AR 上海久亿化学试剂有限公司
无水乙醇 AR 上海久亿化学试剂有限公司
二甲亚砜 AR 国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉 AR 天津市恒兴化学试剂制造有限公司
蔗糖 CP 上海久亿化学试剂有限公司
2.1.2 实验仪器设备
称取一定量的黄连粗粉(m)，称量干燥后的黄连干膏的质量(m1)。
计算公式：
提取率 （1）
式中：m1：干燥后的白头翁干膏的质量，g
m：白头翁粗粉的质量，g
2.2.1 石油醚组分提取工艺
称取黄连细粉（过60目筛）100 g于2000 mL的三口烧瓶中，加入适量溶剂后，60℃水浴加热一定时间、一定次数，提取液经离心或抽滤得滤液和滤渣，滤渣烘干后用于下个溶剂提取，滤液经浓缩烘干后得黄连石油醚干膏。
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