hplc方法测定微波辅助提取金银花中的绿原酸含量(附件)
本人签名： 日期： 摘 要在对金银花进行微波辅助萃取后，用nano-liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (nano-LC-ESI/MS)的方法对提取物中的绿原酸进行了定量测定。微波辅助提取作为金银花一个新的前处理样本制备方法，该方法的程序过程被优化，验证并与传统的提取方法包括回流提取法（RE）和超声提取法（USE）进行了比较。研究发现微波辅助提取具有最高提取效率及最短的提取时间（仅4min）而表现出最好的结果。绿原酸的含量是由基于标准曲线的nano LC-ESI / MS测量的。本论文主要是对测量方法的线性，检测限，精密度和回收率进行考察，研究结果表明，微波辅助提取结合得nano LC-ESI / MS的方法的线性关系（R2 0.991，0.8-20 ng/mL），检测限（0.5 ng/mL），良好的精密度（R.S.D. =2.54％）和回收率（84.8％）。本实验证明，nano LC-ESI / MS结合微波辅助提取是对金银花中绿原酸的快速和可靠定量的方法。 目 录
1 绪论 1
2实验方法与步骤
2.1化学试剂与材料 4
2.2 LCMS的运行条件 4
2.3标准品溶液 4
2.4 萃取程序的比较以及超声辅助提取的参数优化 5
2.4.1 回流提取 5
2.4.2 超声提取 5
2.4.3微波辅助提取以及参数优化 5
2.5方法学验证 5
2.5.1标准曲线及样本的定量 5
2.5.2重现性和回收率 6
3结果与讨论
3.1 分离绿原酸的HPLC的条件优化 7
3.2微波辅助提取与传统提取方法的比较 10
3.3 微波辅助提取程序的参数优化 12
3.4 方法学验证 13
结论 14
参考文献 15
致 谢 17
1 绪论
金银花是忍冬的干花，具有广泛的生物和药理学
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
3结果与讨论
3.1 分离绿原酸的HPLC的条件优化 7
3.2微波辅助提取与传统提取方法的比较 10
3.3 微波辅助提取程序的参数优化 12
3.4 方法学验证 13
结论 14
参考文献 15
致 谢 17
1 绪论
金银花是忍冬的干花，具有广泛的生物和药理学活性，如抗菌、抗病毒[1]和抗氧化[2]。金银花中含有绿原酸、木犀草苷、挥发油、黄酮、皂角苷、多糖及多酚化合物[3]。绿原酸在植物中分布很广，从高等双叶植物到蕨类植物均有报道，主要存在于忍冬科忍冬属、菊科篙属及杜仲科杜仲属植物中，其中含量较高的植物主要有杜仲、金银花、咖啡与可可树。绿原酸为一种有机酸，是植物有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，即一分子咖啡酸与一分子奎宁酸结合而成的酯，异名咖啡鞣酸，也属于酚类化合物。分子式是C16H18O9，其分子具有邻苯二酚的羧基结构，分子量为354.3。在25℃水中溶解度为4%，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于乙酸乙酯。
绿原酸是金银花中主要的生物活性成分，因此绿原酸的含量测定与金银花的品质关系密切。在进行含量分析之前，必须先对金银花中的绿原酸进行提取。回流提取是常规药物提取中广泛应用的传统技术[46]。回流提取具有费力耗时及溶剂使用量大的特点。超声波抽提法也可以应用于绿原酸的提取[7]，能量集中，能形成高的温度，产生剧烈振动，引起激震波、波体中的空化作用等，结果产生机械、热、光、电、化学及生物等各种效应。超声波的热效应使水温基本在57℃,对一些热敏性物质的提取提供了良好的条件，但是对于金银花中的绿原酸的提取效率并不理想。因此，为了从传统中药中提取绿原酸，一种快速、无溶剂和低成本的样品制备技术是非常必要的。微波加热涉及到基于微波辐射引起的导电与介电极化产生的内热[8]。微波辅助提取法是Ganzler于1986年首先提出来的。微波提取技术主要是基于微波的热特性，而微波加热的原理有两个方面，一是通过“介电损耗”(或称为“介电加热”）。热效应的强弱取决于离子的大小、电荷的多少、传导性能及溶剂的相互作用等。微波处理这种方法是适用于对热稳定的产物，如寡糖、多糖、核酸、生物碱、黄酮、苷类等中药成分。用此法可以大大提高提取收率，缩短提取时间的特性和品质。本法已经在生物碱类、有机酸类的提取中得到应用。近年来，微波辅助提取法(MAE)获得越来越多的关注，该法能够显著节约处理时间与降低溶剂消耗，已经表现出替代传统固液提取法的潜质[911]。微波辅助提取法与传统的加热回流相比效率更高，原因在于微波辐射通过样本植物细胞内部的温度和内压的飞升加速了细胞的破裂，从而加速了样品表面的破坏。微波辅助提取法已经应用于从植物基质中提取各种各样的具有生物活性的化合物[1217]。微波辅助提取与GCMS在中药分析中也有应用[18]。
植物作为生物界的重要物种，其种类多样，功效各有特色，更是因为其药用的特点而成为了科学家开发天然药物的重要对象和重要来源。随着中草药的大量利用和认识，中草药的特性及提取物得到了充分的开发。我国加入WTO后，促进了中药行业更好的与国际接轨，有利于引进先进技术和设备，然而中药发展也面临着严峻的挑战。我国的中药企业存在一小、二多、三低的弊端，中药剂型落后，各个环节因为缺乏规范的标准而得不到国际认可。由于技术的不知道跟进与革新，在很多药企中出现了因为工艺技术的不完善和落后，而大量浪费药企的人力资源和生产成本，造成了极大的浪费，更没有带来应有的效益。诸如金银花中绿原酸的提取过程中，需要提取3h，但是提取率仅为15％。提取技术在中药、中药提取物、半成品及成品生产和质量控制中起着非常重要的作用，现在之所以很多质量标准无法制定，检测无法进行，主要是提取手段相对落后。由于中药的传承性和相对落后性，很多中药生产企业固守陈规，不知道突破老旧模式以及生产设备的更新换代缓慢，设备无法满足生产等因素，不仅不能使中药的有效物质得到充分的提取，浪费资源，更会因为提取的不正规而给质量控制带来困难。
近年来，HPLC法在传统中药中的组分分离与分析方面取得了长足的进步。NanoLC是一种高效的分析手段，在内径小于300微米的毛细管（通常在HPLC中包含固定相）中进行。NanoLC与经典的分析方法相比具有几个优点，如较短的时间内能够实现快速分离，流动相每分呼吸量的使用，节约填充材料，低的样品稀释比等[1920]。然而，这种方法由于取样体积小和在UV检测中检测室的路径短，其灵敏度不能满足要求。NanoLC与质谱结果的联用能够显著增加该方法的灵敏度。ESI现在已经成为液相分离在线耦合技术（如LC与MS耦合）中最重要的离子化手段[2123]。LC与ESI/MS耦合的优势有以下几点：1.选择ESI技术能够实现带电基团从液相向气相的迁移；2.联用技术应用范围广，从离子和小分子到大分子大均可应用；3.ESIMS能够检测大分子量分子产生的多个带电基团。从引入小内径色谱柱开始，相对较低的流量及nanoLC体系的典型特征都为这两种技术的耦合提供了便利。因此nanoLCMS技术具有高灵敏度与低检出限，经常用于分析蛋白质组[24]，药用化合物的分析[25]。
所以在此次论文中，我们建立了nanoLCESI/MS测定微波辅助提取金银花中绿原酸含量的方法，并对微波辅助提取的参数进行了优化且与传统的提取手段进行了比较。在论文中还对建立的方法的线性、回收率、精密度以及检测限进行了研究。
2实验方法与步骤
2.1化学试剂与材料
色谱纯的甲醇、乙腈以及甲酸以及分析纯的乙醇；蒸馏水；干燥的金银花；纯度为99.9%的绿原酸标品；离心机
2.2 LCMS的运行条件
nano LCESI / MS系统(LC20ADvp纳米泵，SIL20AC自动进样器，岛津，日本京都)配备纳电喷雾喷雾电离（ESI）接口；采用购买于安捷伦科技公司的Zorbax SBC18柱(150mm×75μm，内径)；流动相由（A）中的0.1％甲酸，（B）乙腈+ 0.1％甲酸， 在116min时段520％B的梯度洗脱，在1624min时段 2040％B，在1min内B迅速升至100％，最后100％B运行4min。流速为300nL min?1.。在质谱分析中分别进行了选择离子监测（SIM）和扫描模式。ESIMS谱需要在正离子模式下。所有质谱都是经过一种在10000 FWHM的分辨率正离子模式且装有ESI源（ESIITTOFMS）的新颖混合型离子阱时间飞行质谱仪（岛津，LCMSITTOF）而被被获得的。通过使用标准的修正材料钠作为内部参考对准确质量进行校准。该分析条件如下：扫描范围，m/z 200650；喷
1 绪论 1
2实验方法与步骤
2.1化学试剂与材料 4
2.2 LCMS的运行条件 4
2.3标准品溶液 4
2.4 萃取程序的比较以及超声辅助提取的参数优化 5
2.4.1 回流提取 5
2.4.2 超声提取 5
2.4.3微波辅助提取以及参数优化 5
2.5方法学验证 5
2.5.1标准曲线及样本的定量 5
2.5.2重现性和回收率 6
3结果与讨论
3.1 分离绿原酸的HPLC的条件优化 7
3.2微波辅助提取与传统提取方法的比较 10
3.3 微波辅助提取程序的参数优化 12
3.4 方法学验证 13
结论 14
参考文献 15
致 谢 17
1 绪论
金银花是忍冬的干花，具有广泛的生物和药理学
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
3结果与讨论
3.1 分离绿原酸的HPLC的条件优化 7
3.2微波辅助提取与传统提取方法的比较 10
3.3 微波辅助提取程序的参数优化 12
3.4 方法学验证 13
结论 14
参考文献 15
致 谢 17
1 绪论
金银花是忍冬的干花，具有广泛的生物和药理学活性，如抗菌、抗病毒[1]和抗氧化[2]。金银花中含有绿原酸、木犀草苷、挥发油、黄酮、皂角苷、多糖及多酚化合物[3]。绿原酸在植物中分布很广，从高等双叶植物到蕨类植物均有报道，主要存在于忍冬科忍冬属、菊科篙属及杜仲科杜仲属植物中，其中含量较高的植物主要有杜仲、金银花、咖啡与可可树。绿原酸为一种有机酸，是植物有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，即一分子咖啡酸与一分子奎宁酸结合而成的酯，异名咖啡鞣酸，也属于酚类化合物。分子式是C16H18O9，其分子具有邻苯二酚的羧基结构，分子量为354.3。在25℃水中溶解度为4%，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于乙酸乙酯。
绿原酸是金银花中主要的生物活性成分，因此绿原酸的含量测定与金银花的品质关系密切。在进行含量分析之前，必须先对金银花中的绿原酸进行提取。回流提取是常规药物提取中广泛应用的传统技术[46]。回流提取具有费力耗时及溶剂使用量大的特点。超声波抽提法也可以应用于绿原酸的提取[7]，能量集中，能形成高的温度，产生剧烈振动，引起激震波、波体中的空化作用等，结果产生机械、热、光、电、化学及生物等各种效应。超声波的热效应使水温基本在57℃,对一些热敏性物质的提取提供了良好的条件，但是对于金银花中的绿原酸的提取效率并不理想。因此，为了从传统中药中提取绿原酸，一种快速、无溶剂和低成本的样品制备技术是非常必要的。微波加热涉及到基于微波辐射引起的导电与介电极化产生的内热[8]。微波辅助提取法是Ganzler于1986年首先提出来的。微波提取技术主要是基于微波的热特性，而微波加热的原理有两个方面，一是通过“介电损耗”(或称为“介电加热”）。热效应的强弱取决于离子的大小、电荷的多少、传导性能及溶剂的相互作用等。微波处理这种方法是适用于对热稳定的产物，如寡糖、多糖、核酸、生物碱、黄酮、苷类等中药成分。用此法可以大大提高提取收率，缩短提取时间的特性和品质。本法已经在生物碱类、有机酸类的提取中得到应用。近年来，微波辅助提取法(MAE)获得越来越多的关注，该法能够显著节约处理时间与降低溶剂消耗，已经表现出替代传统固液提取法的潜质[911]。微波辅助提取法与传统的加热回流相比效率更高，原因在于微波辐射通过样本植物细胞内部的温度和内压的飞升加速了细胞的破裂，从而加速了样品表面的破坏。微波辅助提取法已经应用于从植物基质中提取各种各样的具有生物活性的化合物[1217]。微波辅助提取与GCMS在中药分析中也有应用[18]。
植物作为生物界的重要物种，其种类多样，功效各有特色，更是因为其药用的特点而成为了科学家开发天然药物的重要对象和重要来源。随着中草药的大量利用和认识，中草药的特性及提取物得到了充分的开发。我国加入WTO后，促进了中药行业更好的与国际接轨，有利于引进先进技术和设备，然而中药发展也面临着严峻的挑战。我国的中药企业存在一小、二多、三低的弊端，中药剂型落后，各个环节因为缺乏规范的标准而得不到国际认可。由于技术的不知道跟进与革新，在很多药企中出现了因为工艺技术的不完善和落后，而大量浪费药企的人力资源和生产成本，造成了极大的浪费，更没有带来应有的效益。诸如金银花中绿原酸的提取过程中，需要提取3h，但是提取率仅为15％。提取技术在中药、中药提取物、半成品及成品生产和质量控制中起着非常重要的作用，现在之所以很多质量标准无法制定，检测无法进行，主要是提取手段相对落后。由于中药的传承性和相对落后性，很多中药生产企业固守陈规，不知道突破老旧模式以及生产设备的更新换代缓慢，设备无法满足生产等因素，不仅不能使中药的有效物质得到充分的提取，浪费资源，更会因为提取的不正规而给质量控制带来困难。
近年来，HPLC法在传统中药中的组分分离与分析方面取得了长足的进步。NanoLC是一种高效的分析手段，在内径小于300微米的毛细管（通常在HPLC中包含固定相）中进行。NanoLC与经典的分析方法相比具有几个优点，如较短的时间内能够实现快速分离，流动相每分呼吸量的使用，节约填充材料，低的样品稀释比等[1920]。然而，这种方法由于取样体积小和在UV检测中检测室的路径短，其灵敏度不能满足要求。NanoLC与质谱结果的联用能够显著增加该方法的灵敏度。ESI现在已经成为液相分离在线耦合技术（如LC与MS耦合）中最重要的离子化手段[2123]。LC与ESI/MS耦合的优势有以下几点：1.选择ESI技术能够实现带电基团从液相向气相的迁移；2.联用技术应用范围广，从离子和小分子到大分子大均可应用；3.ESIMS能够检测大分子量分子产生的多个带电基团。从引入小内径色谱柱开始，相对较低的流量及nanoLC体系的典型特征都为这两种技术的耦合提供了便利。因此nanoLCMS技术具有高灵敏度与低检出限，经常用于分析蛋白质组[24]，药用化合物的分析[25]。
所以在此次论文中，我们建立了nanoLCESI/MS测定微波辅助提取金银花中绿原酸含量的方法，并对微波辅助提取的参数进行了优化且与传统的提取手段进行了比较。在论文中还对建立的方法的线性、回收率、精密度以及检测限进行了研究。
2实验方法与步骤
2.1化学试剂与材料
色谱纯的甲醇、乙腈以及甲酸以及分析纯的乙醇；蒸馏水；干燥的金银花；纯度为99.9%的绿原酸标品；离心机
2.2 LCMS的运行条件
nano LCESI / MS系统(LC20ADvp纳米泵，SIL20AC自动进样器，岛津，日本京都)配备纳电喷雾喷雾电离（ESI）接口；采用购买于安捷伦科技公司的Zorbax SBC18柱(150mm×75μm，内径)；流动相由（A）中的0.1％甲酸，（B）乙腈+ 0.1％甲酸， 在116min时段520％B的梯度洗脱，在1624min时段 2040％B，在1min内B迅速升至100％，最后100％B运行4min。流速为300nL min?1.。在质谱分析中分别进行了选择离子监测（SIM）和扫描模式。ESIMS谱需要在正离子模式下。所有质谱都是经过一种在10000 FWHM的分辨率正离子模式且装有ESI源（ESIITTOFMS）的新颖混合型离子阱时间飞行质谱仪（岛津，LCMSITTOF）而被被获得的。通过使用标准的修正材料钠作为内部参考对准确质量进行校准。该分析条件如下：扫描范围，m/z 200650；喷
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