中药中附子多糖的提取工艺优化(附件)
摘 要运用响应面法优化附子多糖的提取工艺，获得最优提取条件，以此提高提取率，为进一步开发研究附子多糖奠定基础。附子用自来水清洗干净，用蒸馏水漂洗，烘干至恒重，粉碎。称取附子用蒸馏水在微波中提取，减压抽滤，浓缩滤液用 sevag法除蛋白后加入４倍体积的95%乙醇，静止24 h，离心，得附子多糖。运用苯酚硫酸法测定糖含量。运用响应面法优化提取工艺，通过单因素试验，确定优化条件的合适范围，设计3因素3水平试验，以提取温度、提取时间、液料比为自变量，响应值为提取率，数学建模得到各因素与响应值之间的关系，使用多元二次回归方程表达，也可形象通过3D响应面图和2D等高线图表示，模拟得到最优提取条件。最后，对回归方程进行ANOVA分析，最佳条件进行验证实验。通过单因素实验得到各因素的合适范围，进行了响应面实验，获得模型预测的最优条件，分别为提取时间为20.15 min，提取温度为64.27℃，液料比为1:20.22 ml/g，提取率为5.6022%单因素实验与响应面实验结果经过运用Design-Expert软件分析，得到多元二项式回归方程及等高线图和响应面图。对回归方程进行方差分析，得到模型p值小于0.0001，说明所选取各因素对响应值提取率的影响是显著的，方程可用于提取条件优化；同时，还对其失拟性0.01215（p＞0.05）进行分析，得到结果为对于纯误差并不显著；最后，对其精密度、变量系数等都进行了验证，证明得该方程精密度、可靠性都较好，是适用于实际情况的条件优化的。验证试验中，最后得到提取率为5.6022%，与预测值几乎一致，说明方程预测是可靠的。
目 录
1 绪论 1
1.1 附子的简介 1
1.1.1 附子的研究进展 1
1.1.2 附子的加工 1
1.1.3 附子中毒 2
1.2 多糖简介 2
1.2.1 抗肿瘤活性 2
1.2.2 抗炎作用 3
1.2.3 抗病毒作用 3
1.3 多糖的提取、纯化及含量测定 3
1.3.1 多糖的提取 3
1.3.2 多糖的纯化 4
1.3.3 多糖含量的测定 4
1.4 响应面法（RSM）简介 5
2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
实验内容 6
2.1 实验材料和试剂、仪器 6
2.2 实验原理 6
2.3 实验方法 6
2.3.1 多糖的提取 7
2.3.2 苯酚溶液的配制 8
2.3.3 葡萄糖标准溶液的配制 8
2.3.4 多糖的含量测定 8
3实验结果与分析 9
3.1 葡萄糖标准曲线 9
3.2 多糖提取的单因素实验 9
3.2.1 提取时间对提取率的影响 9
3.2.2 提取温度对提取率的影响 10
3.2.3 液料比对提取率的影响 10
3.3 多糖提取的优化 11
3.3.1 多项回归方程及其方程分析 11
3.3.2 响应曲面图谱与分析 14
3.3.3 响应面最后优化的结果 16
3.3.4 实验方案的验证 17
结 论 18
参考文献 19
致 谢 21
1 绪论
1.1 附子的简介
附子始载于《神龙本草经》，是一味常用药，它来源于毛莨科植物乌头Aconitumcarmichael Debx.的子根加工品，性辛，甘，大热，有回阳救逆，祛寒止痛的功效，其药用历史悠久，临床疗效显著，用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足、脘腹冷痛、寒湿痹痛等，但同时也是著名的有毒中药，因为附子毒性大，所以在采收后要经过产地加工来减轻它的毒性，并且不同的加工方式对附子的有效成分和附子的毒性成分有不同的影响，《中国药典》规定的加工品有4种，现代常用的有8种。
1.1.1 附子的研究进展
附子作为温里药的代表药物其主要的化学成分有生物碱，多糖，苷类，甾醇和无机盐等等。其中多糖作为有效成分之一，其药理学研究主要集中在对免疫学的研究和抗肿瘤方面。随着生物学及免疫物质的化学研究与发展及新药资源的寻找与开发，附子多糖的有效分离和稳定可控对于附子的全面研究以及附子多糖的全面应用具有重要意义。因此，规范附子多糖的提取与纯化，加强对附子多糖结构的研究，从分子水平揭示附子多糖的药理作用与结构的关系有着重要意义。
1.1.2 附子的加工
附子发现时便记载其有毒，在使用中便特别注意制其毒，附子炮炙方法相当丰富，归根结底都是为了减毒增效，以适应临床需要，古今附子的炮制方法也有较大改变，从汉代至今附子的炮制方法已演变有7O余种之多，清代以来附子则多用胆巴水进行炮制，但很多炮制方法现代已摈弃或不使用了。搞清炮制的工艺及其物质基础、药理、药效、毒理等基本情况，在此基础上根据临床药用要求的不同制订出能全面反映附子炮制质量的指纹图谱和质量标准，从种植、加工、炮制、生产、储存的每一环节对附子进行标准化生产跟踪管理，以保证临床使用附子的安全和有效。
1.1.3 附子中毒
附子的毒性重要来源与所含乌头碱的毒性，但是附子用量的大小与会不会中毒没有绝对的正比关系，引起中毒的原因很多，如个体差异、附子来源和产地不同、辩证不符、超量超时用药、未经炮制或炮制不当、剂型失宜、配伍不合理、煎服有误等等。为了减少或避免附子中毒的发生，首先应加强对附子的监管，其次需要提高医务人员的业务素质，加强医务人员对附子毒性的认识，同时要让患者掌握正确的煎煮及服用方法、准确辩证，严格掌握适应症，把握好给药剂量，适量而止，规范炮制方法，合理配伍应用，正确煎煮服用，选择适宜的剂型。
1.2 多糖简介
多糖是由多个单糖残基经糖苷键连接而成的聚合体，亦称多聚糖，一般具成百上千个单位，相对分子质量较大。多糖因其连接的单糖种类、连接方式、聚合程度、糖苷键的性质不同而不同，只有一种单糖聚合的称为同多糖，如淀粉、糖元、纤维素、壳多糖、琼脂等；不同单糖聚合的称为杂多糖，如透明质酸、硫酸软骨素、肝素等。多糖链可以有分支或无分支，呈直线型或螺旋形、球形，连接的糖苷键一般有α1,4型、α1,6型和β1,4型。多糖作为一种结构材料和贮存物质广泛存在生物体中，作为材料的功能，常成为生物体的支撑介质，不溶于水，如植物的纤维素，动物的甲壳素；贮存能量功能则体现在，可溶于热水成为胶体溶液，酶催化水解多糖释放能量为生物体供能，如人体内的肝糖原、淀粉。随着对多糖的研究深入，人们发现多糖除了基本的支持组织和贮存能量的生理功能以外，特别是水溶性多糖，还具有许多药理活性。如多种植物或中药（如黄芪、真菌类、海生生物）的多糖经提取纯化后，发现其具有较好的抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、清除超氧阴离子、DPPH自由基、ABTS自由基、提高免疫力的功效，其大多数功能和活性同免疫系统有关。虽然对其研究和关注相较其他三大类物质（蛋白质、核酸和脂类）晚，但是其独特而明显的药理活性成为研究的热点，现在国内外已经上市的药品保健品有人参多糖注射液、黄芪多糖注射液等。
1.2.1 抗肿瘤活性
多糖的抗肿瘤活性是通过激活机体的免疫系统，如活化网上内皮系统，促进 各种细胞因子的形成，诱导细胞分化，促进淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞成熟，抑制癌细胞的生长和转移，或加速肿瘤细胞的凋亡，因此不同一般抗癌药物的直接杀伤损害癌细胞而对正常细胞无伤害，这就是具抗肿瘤活性的多糖多无毒的原因。
1.2.2 抗炎作用
多糖具有抗炎作用是由于其可以粘附微生物病原体，阻断对靶细胞的侵入，因此可以消炎，并具抗感染作用。上世纪研究发现的某些细菌产生具有的两性多糖，带有正负离子，对脓肿具有治疗效果，该作用机制为经过MHCII途径激活T细胞发挥作用。目前已有一些多糖抗炎药正在临床试验中，如从牵牛花中提取得到的多乙酰寡糖，对杀灭金黄色葡萄糖球菌效果很好，具有相当的临床应用前景。
1.2.3 抗病毒作用
目前报道的具有抗病毒作用的多糖有很多，如硫酸化半乳聚糖和硫酸木糖等。研究发现，机制为此类多糖可干扰病毒表面的糖蛋白gp 120和淋巴细胞表面CD 4受体的结合。对其化学结构和活性之间的关系研究发现，具抗病毒作用的多糖多具有硫酸根，且存在与否与多寡直接影响抗病毒活性。
目 录
1 绪论 1
1.1 附子的简介 1
1.1.1 附子的研究进展 1
1.1.2 附子的加工 1
1.1.3 附子中毒 2
1.2 多糖简介 2
1.2.1 抗肿瘤活性 2
1.2.2 抗炎作用 3
1.2.3 抗病毒作用 3
1.3 多糖的提取、纯化及含量测定 3
1.3.1 多糖的提取 3
1.3.2 多糖的纯化 4
1.3.3 多糖含量的测定 4
1.4 响应面法（RSM）简介 5
2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
实验内容 6
2.1 实验材料和试剂、仪器 6
2.2 实验原理 6
2.3 实验方法 6
2.3.1 多糖的提取 7
2.3.2 苯酚溶液的配制 8
2.3.3 葡萄糖标准溶液的配制 8
2.3.4 多糖的含量测定 8
3实验结果与分析 9
3.1 葡萄糖标准曲线 9
3.2 多糖提取的单因素实验 9
3.2.1 提取时间对提取率的影响 9
3.2.2 提取温度对提取率的影响 10
3.2.3 液料比对提取率的影响 10
3.3 多糖提取的优化 11
3.3.1 多项回归方程及其方程分析 11
3.3.2 响应曲面图谱与分析 14
3.3.3 响应面最后优化的结果 16
3.3.4 实验方案的验证 17
结 论 18
参考文献 19
致 谢 21
1 绪论
1.1 附子的简介
附子始载于《神龙本草经》，是一味常用药，它来源于毛莨科植物乌头Aconitumcarmichael Debx.的子根加工品，性辛，甘，大热，有回阳救逆，祛寒止痛的功效，其药用历史悠久，临床疗效显著，用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足、脘腹冷痛、寒湿痹痛等，但同时也是著名的有毒中药，因为附子毒性大，所以在采收后要经过产地加工来减轻它的毒性，并且不同的加工方式对附子的有效成分和附子的毒性成分有不同的影响，《中国药典》规定的加工品有4种，现代常用的有8种。
1.1.1 附子的研究进展
附子作为温里药的代表药物其主要的化学成分有生物碱，多糖，苷类，甾醇和无机盐等等。其中多糖作为有效成分之一，其药理学研究主要集中在对免疫学的研究和抗肿瘤方面。随着生物学及免疫物质的化学研究与发展及新药资源的寻找与开发，附子多糖的有效分离和稳定可控对于附子的全面研究以及附子多糖的全面应用具有重要意义。因此，规范附子多糖的提取与纯化，加强对附子多糖结构的研究，从分子水平揭示附子多糖的药理作用与结构的关系有着重要意义。
1.1.2 附子的加工
附子发现时便记载其有毒，在使用中便特别注意制其毒，附子炮炙方法相当丰富，归根结底都是为了减毒增效，以适应临床需要，古今附子的炮制方法也有较大改变，从汉代至今附子的炮制方法已演变有7O余种之多，清代以来附子则多用胆巴水进行炮制，但很多炮制方法现代已摈弃或不使用了。搞清炮制的工艺及其物质基础、药理、药效、毒理等基本情况，在此基础上根据临床药用要求的不同制订出能全面反映附子炮制质量的指纹图谱和质量标准，从种植、加工、炮制、生产、储存的每一环节对附子进行标准化生产跟踪管理，以保证临床使用附子的安全和有效。
1.1.3 附子中毒
附子的毒性重要来源与所含乌头碱的毒性，但是附子用量的大小与会不会中毒没有绝对的正比关系，引起中毒的原因很多，如个体差异、附子来源和产地不同、辩证不符、超量超时用药、未经炮制或炮制不当、剂型失宜、配伍不合理、煎服有误等等。为了减少或避免附子中毒的发生，首先应加强对附子的监管，其次需要提高医务人员的业务素质，加强医务人员对附子毒性的认识，同时要让患者掌握正确的煎煮及服用方法、准确辩证，严格掌握适应症，把握好给药剂量，适量而止，规范炮制方法，合理配伍应用，正确煎煮服用，选择适宜的剂型。
1.2 多糖简介
多糖是由多个单糖残基经糖苷键连接而成的聚合体，亦称多聚糖，一般具成百上千个单位，相对分子质量较大。多糖因其连接的单糖种类、连接方式、聚合程度、糖苷键的性质不同而不同，只有一种单糖聚合的称为同多糖，如淀粉、糖元、纤维素、壳多糖、琼脂等；不同单糖聚合的称为杂多糖，如透明质酸、硫酸软骨素、肝素等。多糖链可以有分支或无分支，呈直线型或螺旋形、球形，连接的糖苷键一般有α1,4型、α1,6型和β1,4型。多糖作为一种结构材料和贮存物质广泛存在生物体中，作为材料的功能，常成为生物体的支撑介质，不溶于水，如植物的纤维素，动物的甲壳素；贮存能量功能则体现在，可溶于热水成为胶体溶液，酶催化水解多糖释放能量为生物体供能，如人体内的肝糖原、淀粉。随着对多糖的研究深入，人们发现多糖除了基本的支持组织和贮存能量的生理功能以外，特别是水溶性多糖，还具有许多药理活性。如多种植物或中药（如黄芪、真菌类、海生生物）的多糖经提取纯化后，发现其具有较好的抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、清除超氧阴离子、DPPH自由基、ABTS自由基、提高免疫力的功效，其大多数功能和活性同免疫系统有关。虽然对其研究和关注相较其他三大类物质（蛋白质、核酸和脂类）晚，但是其独特而明显的药理活性成为研究的热点，现在国内外已经上市的药品保健品有人参多糖注射液、黄芪多糖注射液等。
1.2.1 抗肿瘤活性
多糖的抗肿瘤活性是通过激活机体的免疫系统，如活化网上内皮系统，促进 各种细胞因子的形成，诱导细胞分化，促进淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞成熟，抑制癌细胞的生长和转移，或加速肿瘤细胞的凋亡，因此不同一般抗癌药物的直接杀伤损害癌细胞而对正常细胞无伤害，这就是具抗肿瘤活性的多糖多无毒的原因。
1.2.2 抗炎作用
多糖具有抗炎作用是由于其可以粘附微生物病原体，阻断对靶细胞的侵入，因此可以消炎，并具抗感染作用。上世纪研究发现的某些细菌产生具有的两性多糖，带有正负离子，对脓肿具有治疗效果，该作用机制为经过MHCII途径激活T细胞发挥作用。目前已有一些多糖抗炎药正在临床试验中，如从牵牛花中提取得到的多乙酰寡糖，对杀灭金黄色葡萄糖球菌效果很好，具有相当的临床应用前景。
1.2.3 抗病毒作用
目前报道的具有抗病毒作用的多糖有很多，如硫酸化半乳聚糖和硫酸木糖等。研究发现，机制为此类多糖可干扰病毒表面的糖蛋白gp 120和淋巴细胞表面CD 4受体的结合。对其化学结构和活性之间的关系研究发现，具抗病毒作用的多糖多具有硫酸根，且存在与否与多寡直接影响抗病毒活性。
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