西维因对罗非鱼内分泌干扰效应相关激素和基因表达的影响
本实验以雄性罗非鱼为研究对象，将其暴露于不同浓度的西维因（0.16mg/L、0.8mg/L、2mg/L）中29天，用酶联免疫法对罗非鱼血清卵黄蛋白原(VTG)、雌二醇(E2)、睾酮(T)水平及用RT-PCR对精巢组织3β-HSD1基因表达进行了测定，探讨西维因对罗非鱼内分泌干扰效应相关激素和基因表达的影响。结果表明与阴性对照组相比，0.16mg/L、0.8mg/L、2mg/L西维因实验组下罗非鱼的VTG、E2、T水平在实验期间随时间推移呈曲线上升态势。2mg/L西维因浓度下的E2、T水平从西维因暴露以来在时间效应上是单一增长的趋势,而0.8mg/L西维因浓度下的VTG、E2水平呈现增长抑制再增长的趋势。用RT-PCR检测精巢组织3β-HSD1基因，发现其在不同时间段均有不同程度的表达。与阴性对照组相比，在实验期间各浓度组的3β-HSD1 mRNA 表达量都上升了，说明3β-HSD1一直处于上调作用。0.16mg/L的低浓度组略高于另外两个浓度组，对3β-HSD1具有更明显的促表达作用。
目录
摘要3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1材料与方法 5
1.1 实验材料、试剂、仪器 5
1.1.1实验材料 5
1.1.2实验试剂 5
1.1.3实验仪器 5
1.2实验方法 5
1.2.1 实验设计与处理5
1.2.2 样品准备5
1.2.3血清中卵黄蛋白原（VTG）水平的测定5
1.2.4血清中雌二醇（E2）水平的测定5
1.2.5血清中睾酮（T）水平的测定 5
1.2.6罗非鱼组织中3βHSD1基因表达的检测6
2 ELISA检测罗非鱼内分泌干扰效应相关激素水平6
2.1 西维因对罗非鱼血清中VTG水平的影响 6
2.2西维因对罗非鱼血清中E2水平的影响 7
2.3西维因对罗非鱼血清中T水平的影响 7
3 RTPCR检测罗非鱼内分泌干扰效应相关基因表达8
3.1西维因对罗非鱼精巢组织3βHSD1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
基因表达的影响 8
4 讨论8
4.1 西维因对内分泌干扰效应相关激素的影响 8
4.2 西维因丢内分泌干扰效应相关基因的影响 9
致谢 9
参考文献 10
附录 11
西维因对罗非鱼内分泌干扰效应相关激素和基因表达的影响
引言
西维因，学名1－萘基N甲基氨基甲酸酯，白灰色结晶。分子式C12H10NO2，结构式如图1。分子量201.22，熔点142℃，沸点315℃。微溶于水，在水中溶解度约为百万分之四十，易溶于丙酮，环己酮，乙醇，苯等极性溶剂。
图1 西维因结构式
西维因是世界上第一个商品化广泛使用的氨基甲酸酯类杀虫剂，它作用于141种农作物，防治了565种害虫[1]，它的应用极大地促进了农业的发展。同时，西维因的内分泌干扰效应也备受关注。研究学者发现在鲮鱼产卵前期，不同浓度的西维因暴露严重干扰了鲮鱼的产卵量，繁殖力[2]。对雄性大白鼠的西维因实验，发现喂食30天，其性周期发生改变，精子的能动性显著降低，15mg/kg的西维因能影响大白鼠6磷酸葡萄糖脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性，使其性腺结构和功能异常[3]。高浓度的西维因具有致畸、致癌、致突变等作用[4]。
近阶段研究将西维因归入环境内分泌干扰物质，已经证明其对生物体具有内分泌干扰效应。环境内分泌干扰物（EDCs）是指存在于环境中，并能够干扰机体正常内分泌功能的一类化合物质。这类物质可以干扰生物体发育过程中正常激素的合成，释放，运输，代谢，排出，从而干扰机体内环境的平衡。某些干扰物质甚至通过母体传递给后代，扰乱内分泌系统，导致子代的发育异常[5]。研究表明，一些EDCs会引起女性卵细胞受精率的下降，产生流产、早产等现象；引起部分男性精子异常，男性变性等异常现象；日常生活中人们即使在安全剂量下接触有些EDCs，也会干扰到正常的内分泌功能，引起机体神经系统，免疫系统，生长发育及新陈代谢受到不同程度的不良影响[6]。Krishnan 等人发现双酚A与雌二醇竞争，并与雌激素受体结合从而产生雌激素效应[7]。Meeker等人发现双酚A能造成男性精子损伤增加，同时调查结果显示在不育症男性尿液中检测出的双酚A浓度与雄激素系数，雌二醇等呈负相关关系[89]。2008年，加拿大宣布禁止使用含有双酚A的塑料奶瓶，这是世界上第一个针对化合物对内分泌干扰作用限制其应用的事例[6]。
环境内分泌干扰物并不一定直接作用于受体，而可能通过影响机体内源性激素合成、相关酶活性、相关基因的表达等途径干扰机体的内分泌系统[13]。
图2类固醇激素的合成途径（Gracia et al., 2008）[10]
精巢或卵巢中有不同种类、含量的类固醇激素合成酶，从而产生性激素（图2）。Zhou等[11]（2013）证实了西维因可通过SXR（类固醇外来物质受体）介导的CYP3A和CYP7A1的表达。Cheng等[12]（2006）的实验发现西维因通过妨碍胆固醇向线粒体的转移，从而抑制类固醇激素的合成，这些研究结果直接指向类固醇激素的合成受到相关酶或其基因表达的限制。
本实验选取探究雄性罗非鱼血液中雌二醇(E2),睾酮(T), 卵黄蛋白原（VTG）水平变化趋势，以及性腺3β类固醇脱氢酶合成基因3βHSD1的表达，进一步研究了西维因对罗非鱼内分泌干扰效应相关激素和基因的影响，为深刻西维因对罗非鱼内分泌干扰效应机制的研究提供重要数据。
1 材料与方法
实验材料、试剂、仪器
1.1.1 实验材料
研究对象为雄性尼罗罗非鱼，来源于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地（无锡），平均体重为185.2 ± 11.4 g，平均体长为21.9 ± 1.7 cm。
1.1.2 实验试剂
西维因原药由常州常隆化工有限公司赠送；UNIQ10柱式总RNA提取试剂盒；丙酮来源于生工生物工程（上海）有限公司；酶联免疫试剂盒等来源于美国R&D公司生产；反转录试剂盒，PCR扩增试剂盒等等。
目录
摘要3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1材料与方法 5
1.1 实验材料、试剂、仪器 5
1.1.1实验材料 5
1.1.2实验试剂 5
1.1.3实验仪器 5
1.2实验方法 5
1.2.1 实验设计与处理5
1.2.2 样品准备5
1.2.3血清中卵黄蛋白原（VTG）水平的测定5
1.2.4血清中雌二醇（E2）水平的测定5
1.2.5血清中睾酮（T）水平的测定 5
1.2.6罗非鱼组织中3βHSD1基因表达的检测6
2 ELISA检测罗非鱼内分泌干扰效应相关激素水平6
2.1 西维因对罗非鱼血清中VTG水平的影响 6
2.2西维因对罗非鱼血清中E2水平的影响 7
2.3西维因对罗非鱼血清中T水平的影响 7
3 RTPCR检测罗非鱼内分泌干扰效应相关基因表达8
3.1西维因对罗非鱼精巢组织3βHSD1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
基因表达的影响 8
4 讨论8
4.1 西维因对内分泌干扰效应相关激素的影响 8
4.2 西维因丢内分泌干扰效应相关基因的影响 9
致谢 9
参考文献 10
附录 11
西维因对罗非鱼内分泌干扰效应相关激素和基因表达的影响
引言
西维因，学名1－萘基N甲基氨基甲酸酯，白灰色结晶。分子式C12H10NO2，结构式如图1。分子量201.22，熔点142℃，沸点315℃。微溶于水，在水中溶解度约为百万分之四十，易溶于丙酮，环己酮，乙醇，苯等极性溶剂。
图1 西维因结构式
西维因是世界上第一个商品化广泛使用的氨基甲酸酯类杀虫剂，它作用于141种农作物，防治了565种害虫[1]，它的应用极大地促进了农业的发展。同时，西维因的内分泌干扰效应也备受关注。研究学者发现在鲮鱼产卵前期，不同浓度的西维因暴露严重干扰了鲮鱼的产卵量，繁殖力[2]。对雄性大白鼠的西维因实验，发现喂食30天，其性周期发生改变，精子的能动性显著降低，15mg/kg的西维因能影响大白鼠6磷酸葡萄糖脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性，使其性腺结构和功能异常[3]。高浓度的西维因具有致畸、致癌、致突变等作用[4]。
近阶段研究将西维因归入环境内分泌干扰物质，已经证明其对生物体具有内分泌干扰效应。环境内分泌干扰物（EDCs）是指存在于环境中，并能够干扰机体正常内分泌功能的一类化合物质。这类物质可以干扰生物体发育过程中正常激素的合成，释放，运输，代谢，排出，从而干扰机体内环境的平衡。某些干扰物质甚至通过母体传递给后代，扰乱内分泌系统，导致子代的发育异常[5]。研究表明，一些EDCs会引起女性卵细胞受精率的下降，产生流产、早产等现象；引起部分男性精子异常，男性变性等异常现象；日常生活中人们即使在安全剂量下接触有些EDCs，也会干扰到正常的内分泌功能，引起机体神经系统，免疫系统，生长发育及新陈代谢受到不同程度的不良影响[6]。Krishnan 等人发现双酚A与雌二醇竞争，并与雌激素受体结合从而产生雌激素效应[7]。Meeker等人发现双酚A能造成男性精子损伤增加，同时调查结果显示在不育症男性尿液中检测出的双酚A浓度与雄激素系数，雌二醇等呈负相关关系[89]。2008年，加拿大宣布禁止使用含有双酚A的塑料奶瓶，这是世界上第一个针对化合物对内分泌干扰作用限制其应用的事例[6]。
环境内分泌干扰物并不一定直接作用于受体，而可能通过影响机体内源性激素合成、相关酶活性、相关基因的表达等途径干扰机体的内分泌系统[13]。
图2类固醇激素的合成途径（Gracia et al., 2008）[10]
精巢或卵巢中有不同种类、含量的类固醇激素合成酶，从而产生性激素（图2）。Zhou等[11]（2013）证实了西维因可通过SXR（类固醇外来物质受体）介导的CYP3A和CYP7A1的表达。Cheng等[12]（2006）的实验发现西维因通过妨碍胆固醇向线粒体的转移，从而抑制类固醇激素的合成，这些研究结果直接指向类固醇激素的合成受到相关酶或其基因表达的限制。
本实验选取探究雄性罗非鱼血液中雌二醇(E2),睾酮(T), 卵黄蛋白原（VTG）水平变化趋势，以及性腺3β类固醇脱氢酶合成基因3βHSD1的表达，进一步研究了西维因对罗非鱼内分泌干扰效应相关激素和基因的影响，为深刻西维因对罗非鱼内分泌干扰效应机制的研究提供重要数据。
1 材料与方法
实验材料、试剂、仪器
1.1.1 实验材料
研究对象为雄性尼罗罗非鱼，来源于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地（无锡），平均体重为185.2 ± 11.4 g，平均体长为21.9 ± 1.7 cm。
1.1.2 实验试剂
西维因原药由常州常隆化工有限公司赠送；UNIQ10柱式总RNA提取试剂盒；丙酮来源于生工生物工程（上海）有限公司；酶联免疫试剂盒等来源于美国R&D公司生产；反转录试剂盒，PCR扩增试剂盒等等。
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