转popw基因载体及拟南芥植株构建
Hrp 基因决定着革兰氏阴性植物病原细菌激发非寄主植物过敏反应能力（hypersensitive responses , HR）和寄主植物的基本寄生性或致病性（parasitism or pathogenicity ）。Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌Hrp基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质，富含甘氨酸（Gly），缺少半胱氨酸（Cys），对蛋白酶敏感，对热稳定，大多会影响病原菌对寄主植物的毒性。Harpin蛋白具有增强植物抗旱性，诱导植物抗病、抗虫，促进植物生长等作用[1]-[3]。popW是从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定出的编码一种新的Harpin蛋白大小为1142bp的基因，其编码的PopW蛋白是一种新的Harpin蛋白，实验中分别构建含不同PopW蛋白的基因片段全长PopW蛋白基因（pBI121-PopW）、PopW蛋白N端结构域基因（pBI121-PopW-N）及PopW蛋白C端结构域基因（pBI121-PopW-C）的双元载体，对拟南芥采取浸花法[4]进行转基因植株构建，研究popW 基因对植株影响。
目录
摘要 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 菌株 2
1．1．2 主要试剂 2
1．1．3 培养基 3
1．2目的基因的克隆 3
1．2．1青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组DNA的提取 3
1．2．2目的基因的克隆 3
1．2．3目的基因的PCR扩增及产物纯化 4
1．2．4 PCR产物与克隆载体的连接 5
1．2．5大肠杆菌感受态的制备 5
1．2．6连接产物的转化 6
1．2．7质粒提取 6
1．2．8酶切验证 7
1．3植物表达载体的构建 7
1．3．1提取质粒 7
1．3．2琼脂糖电泳分析 7
1．3．3质粒酶切 7
1．3．4琼脂糖凝胶DNA片段回收 8
1．3．5将目的基因连接到pBI121载 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
体上 8
1．4重组质粒的验证 8
1．4．1大肠杆菌感受态的制备 8
1．4．2连接产物的转化 8
1．4．3菌落PCR验证 8
1．4．4质粒提取 9
1．4．5酶切验证 9
1．4．6重组质粒测序验证 9
1．5重组质粒导入土壤杆菌 9
1．5．1土壤杆菌感受态细胞的制备 9
1．5．2土壤杆菌感受态细胞的转化 9
1．5．3转化子的鉴定 9
1．6 转基因拟南芥的产生 9
1．6．1拟南芥植株培养 9
1．6．2浸花法获得转基因植株 10
1．6．3 转化种子的筛选 10
1．7转基因拟南芥检测 10
2 结果与分析 11
2．1 目的基因的克隆 11
2．2 植物表达载体的构建 12
2．3 重组质粒的验证与转化 12
2．4 浸花法获得转基因拟南芥 13
3 讨论 13
致谢 14
参考文献： 14
转popW基因载体及拟南芥植株构建
引言
引言 Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌Hrp基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质。Hrp 基因决定着革兰氏阴性植物病原细菌激发非寄主植物过敏反应能力（hypersensitive responses,HR）和寄主植物的基本寄生性或致病性（parasitism or pathogenicity ）[5]。Hrp 基因决定细菌的致病性，但它并不能编码细菌一般生长、代谢所需的物质。到目前为止，在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中都发现了hrp基因。
实验发现Harpin蛋白都不是亲和病原细菌在烟草上诱导过敏反应（HR）或过敏性细胞死亡（hypersensitive cell death , HCD）的效应分子，除HarpinPss 外，其他harpin蛋白均可作为病原细菌的毒性因子起作用；在病原物侵染植物过程中，Ⅲ型效应分子被输送到植物细胞，而harpin蛋白的主要功能是协助Avr 或Dsp 进入细胞内[6]。有研究表明hrp诱导植物产生系统抗性属于水杨酸介导的诱导系统获得性抗性(Systemic?acquired?resistance , SAR）[7]。在非寄主上使用Harpin蛋白，可引起植物产生多种有益反应，如提高作物的抗病、抗虫能力、促进植物生长和增强植物的抗逆性等，同时研究发现转Harpin基因的作物对干旱、盐胁迫和冻害的各种逆境表现出较高的耐受性[8]，从各类病原菌中寻找产生Harpin的hrp 基因以及研究其诱导防卫反应机制已成为分子植物病理学一个新的研究热点。徐进平等研究发现经Harpin蛋白处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用[9]。赵倩等研究表明harpin重组菌株，对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum具有抑制作用[10]。并且Harpin可以诱导植物的抗虫性。HarpinXoo和HarpinXoc 处理离体棉花叶片，可以诱导棉花对棉蚜的抗性，降低60%的虫口密度[11][12]。
popW是从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定出的编码一种新的Harpin蛋白大小为1142bp的基因，其编码的PopW蛋白是一种新的Harpin蛋白，它同以前报道的类物质具有相同的性质酸性，富含甘氨酸和丝氨酸，缺少半胱氨酸并且是一种耐热蛋白。在一级结构上，PopW蛋白是由两个结构域组成，包括N末端159个氨基酸的harpin结构域和C末端207个氨基酸组成的果胶酶的结构域，他们之间由富含甘氨酸和丝氨酸的短肽连接起来[13]。popW的harpin结构域也能引起烟草发生HR反应。虽然popW具有果胶酶结构域，但并没有果胶酶活性。另外，研究从其它十九个不同遗传多样性的青枯劳尔氏菌中都扩增到了popW基因，这说明popW是广泛存在于青枯劳尔氏菌中。把popW和绿色荧光蛋白（GFP）构成融合基因，连接至植物转基因载体pBI121，在土壤杆菌的介导下转入洋葱表皮细胞。荧光显微镜观察结果表明，PopW蛋白是定位在植物的细胞壁上。因此，可以推测popW在青枯劳尔氏菌与寄主互作的过程中起帮助定殖的作用。通过popW的缺失突变体菌株的接种实验发现popW对非寄主植物烟草的HR反应和寄主植物的致病过程中不起决定作用。实验证明PopW是青枯劳尔氏菌中广泛存在的一个定位于寄主细胞壁上，受hrpB基因的调控，通过Ⅲ型泌出系统分泌到胞外的且不影响菌株对寄主致病性的新harpin蛋白[14]。
鉴于PopW蛋白的诱导抗病性功能，构建popW转基因拟南芥，以进一步研究其在拟南芥中的表达及抗病性植物效应。
1.材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
目录
摘要 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 菌株 2
1．1．2 主要试剂 2
1．1．3 培养基 3
1．2目的基因的克隆 3
1．2．1青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组DNA的提取 3
1．2．2目的基因的克隆 3
1．2．3目的基因的PCR扩增及产物纯化 4
1．2．4 PCR产物与克隆载体的连接 5
1．2．5大肠杆菌感受态的制备 5
1．2．6连接产物的转化 6
1．2．7质粒提取 6
1．2．8酶切验证 7
1．3植物表达载体的构建 7
1．3．1提取质粒 7
1．3．2琼脂糖电泳分析 7
1．3．3质粒酶切 7
1．3．4琼脂糖凝胶DNA片段回收 8
1．3．5将目的基因连接到pBI121载 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
体上 8
1．4重组质粒的验证 8
1．4．1大肠杆菌感受态的制备 8
1．4．2连接产物的转化 8
1．4．3菌落PCR验证 8
1．4．4质粒提取 9
1．4．5酶切验证 9
1．4．6重组质粒测序验证 9
1．5重组质粒导入土壤杆菌 9
1．5．1土壤杆菌感受态细胞的制备 9
1．5．2土壤杆菌感受态细胞的转化 9
1．5．3转化子的鉴定 9
1．6 转基因拟南芥的产生 9
1．6．1拟南芥植株培养 9
1．6．2浸花法获得转基因植株 10
1．6．3 转化种子的筛选 10
1．7转基因拟南芥检测 10
2 结果与分析 11
2．1 目的基因的克隆 11
2．2 植物表达载体的构建 12
2．3 重组质粒的验证与转化 12
2．4 浸花法获得转基因拟南芥 13
3 讨论 13
致谢 14
参考文献： 14
转popW基因载体及拟南芥植株构建
引言
引言 Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌Hrp基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质。Hrp 基因决定着革兰氏阴性植物病原细菌激发非寄主植物过敏反应能力（hypersensitive responses,HR）和寄主植物的基本寄生性或致病性（parasitism or pathogenicity ）[5]。Hrp 基因决定细菌的致病性，但它并不能编码细菌一般生长、代谢所需的物质。到目前为止，在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中都发现了hrp基因。
实验发现Harpin蛋白都不是亲和病原细菌在烟草上诱导过敏反应（HR）或过敏性细胞死亡（hypersensitive cell death , HCD）的效应分子，除HarpinPss 外，其他harpin蛋白均可作为病原细菌的毒性因子起作用；在病原物侵染植物过程中，Ⅲ型效应分子被输送到植物细胞，而harpin蛋白的主要功能是协助Avr 或Dsp 进入细胞内[6]。有研究表明hrp诱导植物产生系统抗性属于水杨酸介导的诱导系统获得性抗性(Systemic?acquired?resistance , SAR）[7]。在非寄主上使用Harpin蛋白，可引起植物产生多种有益反应，如提高作物的抗病、抗虫能力、促进植物生长和增强植物的抗逆性等，同时研究发现转Harpin基因的作物对干旱、盐胁迫和冻害的各种逆境表现出较高的耐受性[8]，从各类病原菌中寻找产生Harpin的hrp 基因以及研究其诱导防卫反应机制已成为分子植物病理学一个新的研究热点。徐进平等研究发现经Harpin蛋白处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用[9]。赵倩等研究表明harpin重组菌株，对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum具有抑制作用[10]。并且Harpin可以诱导植物的抗虫性。HarpinXoo和HarpinXoc 处理离体棉花叶片，可以诱导棉花对棉蚜的抗性，降低60%的虫口密度[11][12]。
popW是从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定出的编码一种新的Harpin蛋白大小为1142bp的基因，其编码的PopW蛋白是一种新的Harpin蛋白，它同以前报道的类物质具有相同的性质酸性，富含甘氨酸和丝氨酸，缺少半胱氨酸并且是一种耐热蛋白。在一级结构上，PopW蛋白是由两个结构域组成，包括N末端159个氨基酸的harpin结构域和C末端207个氨基酸组成的果胶酶的结构域，他们之间由富含甘氨酸和丝氨酸的短肽连接起来[13]。popW的harpin结构域也能引起烟草发生HR反应。虽然popW具有果胶酶结构域，但并没有果胶酶活性。另外，研究从其它十九个不同遗传多样性的青枯劳尔氏菌中都扩增到了popW基因，这说明popW是广泛存在于青枯劳尔氏菌中。把popW和绿色荧光蛋白（GFP）构成融合基因，连接至植物转基因载体pBI121，在土壤杆菌的介导下转入洋葱表皮细胞。荧光显微镜观察结果表明，PopW蛋白是定位在植物的细胞壁上。因此，可以推测popW在青枯劳尔氏菌与寄主互作的过程中起帮助定殖的作用。通过popW的缺失突变体菌株的接种实验发现popW对非寄主植物烟草的HR反应和寄主植物的致病过程中不起决定作用。实验证明PopW是青枯劳尔氏菌中广泛存在的一个定位于寄主细胞壁上，受hrpB基因的调控，通过Ⅲ型泌出系统分泌到胞外的且不影响菌株对寄主致病性的新harpin蛋白[14]。
鉴于PopW蛋白的诱导抗病性功能，构建popW转基因拟南芥，以进一步研究其在拟南芥中的表达及抗病性植物效应。
1.材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
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