新的大豆疫霉分泌蛋白家族的生物信息学鉴定及功能分析
在大豆疫霉的基因组中存在着许多的外泌蛋白基因。除了典型的 RXLR，CRN 和 NLP 等家族外，还有许多功能未知的蛋白家族。通过生物信息学分析筛选到 OG5_154821 外泌家族，在侵染过程中高表达。利用植物表达载体在烟草上过表达该家族的部分成员基因，筛选到候选效应分子 Ps_128701 能够引起细胞坏死；Ps_135475可以抑制辣椒疫霉对烟草的侵染。但是这两个基因如何发挥功能仍需要进一步的分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 针对大豆疫霉的生物信息学分析3
1.2 提取质粒及农杆菌转化3
1.2.1 大肠杆菌质粒提取3
1.2.2 农杆菌转化3
1.2.2.1 农杆菌GV1301感受态制备3
1.2.2.2 电击法转化农杆菌4
1.3 RNA提取，逆转录和定量过程4
1.3.1 RNA提取4
1.3.2 RNA逆转录与定量PCR4
1.3.2.1 逆转录反应体系与程序4
1.3.2.1.1 去除RNA中的DNA4
1.3.2.1.2 RNA逆转录4
1.3.2.2 定量PCR5
1.4 大肠杆菌JM109感受态的制作及转化5
1.4.1 大肠杆菌感受态的制作5
1.4.2 大肠杆菌的转化6
1.5 试验用菌株的培养和保存6
1.6 辣椒疫霉的接种方法6
2 结果与讨论6
2.1 OG5_154821 外泌家族基因的克隆6
2.2 OG5_154821 外泌家族的功能分析6
2.2.1 Ps_128701引起植物细胞坏死的作用6
2.2.2 候选效应分子 Ps_128701 在不同侵染时期的转录模式7
2.2.3 候选效应分子对辣椒疫霉侵染的影响8
3 讨论8
致谢9
参考文献10 新的大豆疫霉分泌蛋白家族的生物信息 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
学鉴定及功能分析
引言
1 选题背景
大豆疫霉病原菌可以在大豆的主要产区广泛传播。大豆疫霉可以侵染种子，根，茎和叶片，在高感病品种中，它可以导致作物颗粒无收。疫霉属属于半活体营养型致病菌。在最初的活体营养生长阶段，疫霉菌与植物建立了亲密的联系，并且以植物组织为食。在后续的侵染过程中，随着病害的发展，寄居在植物上的疫霉菌导致细胞死亡组织崩溃。与细菌侵染过程类似，疫霉菌同样利用效应子蛋白来操纵植物免疫，进而完成持续的活体寄生。大豆疫霉可以形成指状吸器，嵌入大豆细胞的细胞膜上[1]。
2 效应分子简介及研究进展
疫霉菌分泌大量的效应子，它们具有双重功能，在寄主植物中不含有相应抗病蛋白时，效应子可以抑制植物的防卫反应，促进病原菌的侵染；当寄主植物中含有与之对应的抗病蛋白时，效应子可被寄主植物识别，激发效应子触发的免疫反应(effectortriggered immunity，ETI)，此时的效应子称为无毒蛋白(Avirulence protein，Avr)。
病原菌效应子分泌到寄主中其作用的位置不同。以此为标准，大豆疫霉的效应子可以分类为胞内效应子和胞外效应子。
胞外效应分子通常会抑制植物基础防御反应，例如水解酶。大豆疫霉可以分泌葡聚糖酶抑制剂蛋白，这种蛋白可以抑制大豆的葡聚糖内切酶 EGaseA。EGaseA可以水解大豆疫霉的细胞壁，释放可以用作免疫激发子的葡聚糖。而葡聚糖酶抑制剂可以抑制防卫反应的激发[2]。据估计大豆疫霉可以产生22个蛋白水解酶来抑制外质体效应子的水解[3]。其中，EPIC3可以在野生的马铃薯和番茄中发现，其具有类似于木瓜蛋白的特性，是一种胞外半胱氨酸蛋白酶抑制剂[4]。至今EPIC3在侵染大豆时的具体功能和目标位点都尚不明了。
另一类胞外效应子是一类与Nep1蛋白相类似，且含有NPP1保守功能域和GHRHDWE七肽基序的效应子，被命名为NLPs（Nep1like Proteins）。该类效应因子可以导致细胞死亡。在N端的分泌信号后，NLPs拥有一个半保守的区域，被称为NPP1（necrosisinducing Phytophthora protein 1）域[5]。这种结构域存在于33种NLPs和其它37个大豆疫霉中的假性基因中。有意思的是，许多PsNLPs 可在游动孢子萌发阶段或在侵染的中后期特异表达，表明它们可以促进早期的寄生，同时也可以是大豆疫霉从活体营养过渡到死体营养，加速植物细胞死亡。
细胞质效应子是从外部的吸器通过一个内吞的过程进入植物细胞，在这个过程中需要寄主靶向模体。卵菌中，两种寄主靶向模体已经被定义了：RxLRdEER 模体和LxLFLAK模体，相应的，细胞质效应子被进一步分为RxLR效应子和Crinklers（CRN）效应子。基于 N末端分泌信号和寄主靶向模体的存在，大豆疫霉基因组编码了大约400个RxLR效应子和100个CRN效应子[3]。
从RxLR效应子被定义开始，它就被投入了的大量的研究。RxLR模体在功能上可以与来自疟疾上的易位蛋白进行替换，证明了动物与植物病原菌有同一套类似的效应子交换机制。大学卵菌与真菌分子生物学实验室已经对大豆疫霉RxLR效应子的功能进行了大规模的筛选，发现大多数RxLR效应子可以抑制寄主植物的细胞死亡[6]，也有一些能够诱导植物的免疫反应[7]。例如，Avh241是一个可以定位于植物细胞膜上的效应子，该效应子可以诱导不同植物的防卫反应，引起植物细胞强烈死亡[7]。
CRN效应子是另一类重要的效应子家族，它只能由卵菌产生。因为CRNs在其他的一些关系距离较远的卵菌上被发现，其中包括了不产生RxLR效应子的Pythium spp.[8]，它们可能是一类比较古老的效应子，对于侵染而言，是基本而且重要的。在大豆疫霉侵染的过程中，CRNs效应子的平均表达量是要比RxLR效应子表达量高，证明了CRNs有着重要的毒性[9]。当一些CRNs在植物中释放的时候，可以触发植物细胞死亡。但是许多CRNs可以触发PTI/ETI，或者可以促进疫霉菌的侵染[9][11]。CRN在细胞中表达的时候主要定位在细胞核内[11]。大豆疫霉PsCRN63 和 PsCRN115 与植物过氧化氢酶进行互作之后进入细胞核内[12].这个发现表明了细胞核定位和CRNs毒力活性之间的联系。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 针对大豆疫霉的生物信息学分析3
1.2 提取质粒及农杆菌转化3
1.2.1 大肠杆菌质粒提取3
1.2.2 农杆菌转化3
1.2.2.1 农杆菌GV1301感受态制备3
1.2.2.2 电击法转化农杆菌4
1.3 RNA提取，逆转录和定量过程4
1.3.1 RNA提取4
1.3.2 RNA逆转录与定量PCR4
1.3.2.1 逆转录反应体系与程序4
1.3.2.1.1 去除RNA中的DNA4
1.3.2.1.2 RNA逆转录4
1.3.2.2 定量PCR5
1.4 大肠杆菌JM109感受态的制作及转化5
1.4.1 大肠杆菌感受态的制作5
1.4.2 大肠杆菌的转化6
1.5 试验用菌株的培养和保存6
1.6 辣椒疫霉的接种方法6
2 结果与讨论6
2.1 OG5_154821 外泌家族基因的克隆6
2.2 OG5_154821 外泌家族的功能分析6
2.2.1 Ps_128701引起植物细胞坏死的作用6
2.2.2 候选效应分子 Ps_128701 在不同侵染时期的转录模式7
2.2.3 候选效应分子对辣椒疫霉侵染的影响8
3 讨论8
致谢9
参考文献10 新的大豆疫霉分泌蛋白家族的生物信息 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
学鉴定及功能分析
引言
1 选题背景
大豆疫霉病原菌可以在大豆的主要产区广泛传播。大豆疫霉可以侵染种子，根，茎和叶片，在高感病品种中，它可以导致作物颗粒无收。疫霉属属于半活体营养型致病菌。在最初的活体营养生长阶段，疫霉菌与植物建立了亲密的联系，并且以植物组织为食。在后续的侵染过程中，随着病害的发展，寄居在植物上的疫霉菌导致细胞死亡组织崩溃。与细菌侵染过程类似，疫霉菌同样利用效应子蛋白来操纵植物免疫，进而完成持续的活体寄生。大豆疫霉可以形成指状吸器，嵌入大豆细胞的细胞膜上[1]。
2 效应分子简介及研究进展
疫霉菌分泌大量的效应子，它们具有双重功能，在寄主植物中不含有相应抗病蛋白时，效应子可以抑制植物的防卫反应，促进病原菌的侵染；当寄主植物中含有与之对应的抗病蛋白时，效应子可被寄主植物识别，激发效应子触发的免疫反应(effectortriggered immunity，ETI)，此时的效应子称为无毒蛋白(Avirulence protein，Avr)。
病原菌效应子分泌到寄主中其作用的位置不同。以此为标准，大豆疫霉的效应子可以分类为胞内效应子和胞外效应子。
胞外效应分子通常会抑制植物基础防御反应，例如水解酶。大豆疫霉可以分泌葡聚糖酶抑制剂蛋白，这种蛋白可以抑制大豆的葡聚糖内切酶 EGaseA。EGaseA可以水解大豆疫霉的细胞壁，释放可以用作免疫激发子的葡聚糖。而葡聚糖酶抑制剂可以抑制防卫反应的激发[2]。据估计大豆疫霉可以产生22个蛋白水解酶来抑制外质体效应子的水解[3]。其中，EPIC3可以在野生的马铃薯和番茄中发现，其具有类似于木瓜蛋白的特性，是一种胞外半胱氨酸蛋白酶抑制剂[4]。至今EPIC3在侵染大豆时的具体功能和目标位点都尚不明了。
另一类胞外效应子是一类与Nep1蛋白相类似，且含有NPP1保守功能域和GHRHDWE七肽基序的效应子，被命名为NLPs（Nep1like Proteins）。该类效应因子可以导致细胞死亡。在N端的分泌信号后，NLPs拥有一个半保守的区域，被称为NPP1（necrosisinducing Phytophthora protein 1）域[5]。这种结构域存在于33种NLPs和其它37个大豆疫霉中的假性基因中。有意思的是，许多PsNLPs 可在游动孢子萌发阶段或在侵染的中后期特异表达，表明它们可以促进早期的寄生，同时也可以是大豆疫霉从活体营养过渡到死体营养，加速植物细胞死亡。
细胞质效应子是从外部的吸器通过一个内吞的过程进入植物细胞，在这个过程中需要寄主靶向模体。卵菌中，两种寄主靶向模体已经被定义了：RxLRdEER 模体和LxLFLAK模体，相应的，细胞质效应子被进一步分为RxLR效应子和Crinklers（CRN）效应子。基于 N末端分泌信号和寄主靶向模体的存在，大豆疫霉基因组编码了大约400个RxLR效应子和100个CRN效应子[3]。
从RxLR效应子被定义开始，它就被投入了的大量的研究。RxLR模体在功能上可以与来自疟疾上的易位蛋白进行替换，证明了动物与植物病原菌有同一套类似的效应子交换机制。大学卵菌与真菌分子生物学实验室已经对大豆疫霉RxLR效应子的功能进行了大规模的筛选，发现大多数RxLR效应子可以抑制寄主植物的细胞死亡[6]，也有一些能够诱导植物的免疫反应[7]。例如，Avh241是一个可以定位于植物细胞膜上的效应子，该效应子可以诱导不同植物的防卫反应，引起植物细胞强烈死亡[7]。
CRN效应子是另一类重要的效应子家族，它只能由卵菌产生。因为CRNs在其他的一些关系距离较远的卵菌上被发现，其中包括了不产生RxLR效应子的Pythium spp.[8]，它们可能是一类比较古老的效应子，对于侵染而言，是基本而且重要的。在大豆疫霉侵染的过程中，CRNs效应子的平均表达量是要比RxLR效应子表达量高，证明了CRNs有着重要的毒性[9]。当一些CRNs在植物中释放的时候，可以触发植物细胞死亡。但是许多CRNs可以触发PTI/ETI，或者可以促进疫霉菌的侵染[9][11]。CRN在细胞中表达的时候主要定位在细胞核内[11]。大豆疫霉PsCRN63 和 PsCRN115 与植物过氧化氢酶进行互作之后进入细胞核内[12].这个发现表明了细胞核定位和CRNs毒力活性之间的联系。
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