禾谷镰孢菌β2微管蛋白的原核表达以及药剂结合
摘要：我国长期采用苯并咪唑类杀菌剂多菌灵防治禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum Schw）引起的小麦赤霉病 (Fusarium head blight of wheat)。周明国研究小组根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum) 对多菌灵(MBC)敏感和抗药性菌株的细胞毒理学观察，发现是MBC抗性（MBCR）菌株的β2微管蛋白（β2 tub）的167、198或200位氨基酸发生突变，本研究通过把β2微管蛋白同MBP标签融合，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达及纯化，结果表明MBP标签能够显著提高微管蛋白的可溶性并成功表达纯化出大量可溶性高纯度微管蛋白。但是MBP-tub融合蛋白的标签切除并没有成功。采用荧光淬灭的方法来测定多菌灵和微管蛋白之间的互作，随着药剂浓度的升高，荧光淬灭率越高，结果表明微管蛋白和多菌灵之间是存在互作的。本文采用MBP融合标签制备出了大量高纯度，可溶性的β2微管蛋白，为进一步构建抗微管蛋白药剂的高通量筛选平台奠定基础，有利于药剂抗性的研究以及新的抗微管蛋白药剂的开发。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1供试菌株、质粒及宿主菌2
1.1.2主要试剂 2
1.2方法 2
1.2.1引物的设计与合成2
1.2.2原核表达载体构建3
1.2.3融合蛋白的诱导表达及纯化3
1.2.4 Western blot分析4
1.2.5 融合标签的切除 5
1.2.6 药剂结合 5
2结果分析 6
2.1 RTPCR 扩增结果 6
2.2 阳性重组质粒验证 6
2.3重组蛋白的纯化与可溶性表达 7
2.4 重组蛋白的酶切 7
2.5 药剂互作 8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
禾谷镰孢菌β2微管蛋白的原核表达以及药剂结合
引言
小
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
麦赤霉病 (Fusarium head blight of wheat) 是中国小麦最重要的病害之一。其病原菌的无性态为禾谷镰孢菌( Fusarium graminearum Schw )，有性态为玉蜀黍赤霉[Gibberella zeae (Schew.), Retch][1]。目前在国内小麦赤霉病综合防治体系中，使用苯并咪唑类（如多菌灵）杀菌剂是防治这种病害流行最常用、最有效的措施。但是，病原菌对这类杀菌剂易发生高水平抗药性突变，在杀菌剂高选择压力下会迅速形成抗药性群体[23]。随着抗性群体的扩大，常常造成药剂防治突然失效，造成产量严重损失。
苯并咪唑类杀菌剂的作用机制主要是通过与病原菌的β微管蛋白结合, 阻止β微管蛋白与α微管蛋白组装成微管, 导致纺锤体不能形成, 进而阻止真菌细胞的有丝分裂。大量研究表明，许多真菌对多菌灵的抗药性机制是β 微管蛋白基因发生点突变，造成蛋白的三维构象发生改变，导致药剂与靶标的亲和性下降或丧失。田间抗药性菌株的突变位点一般位于β2 微管蛋白167、198或200位氨基酸，198位氨基酸突变（198Glu→Ala）表现为乙霉威和N苯氨基甲酸酯类杀菌剂的负交互抗性[46]。
周明国研究小组根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum) 对多菌灵(MBC)敏感和抗药性菌株的细胞毒理学观察，发现MBCR菌株的β1微管蛋白基因（β1tub）未发生任何位点的突变，而是β2 微管蛋白（β2tub）的167、198或200位氨基酸发生突变，说明F. graminearum 对MBC的抗药性机制与其他丝状真菌不同[7]。目前因为微管蛋白在丝状真菌组织中的丰度很低，直接制备有很大困难[8]。为了客服这些困难得到大量高纯度的活性微管蛋白，本文采用MBP融合标签结合BL21（DE3）表达宿主菌来异源表达禾谷镰孢菌的β2微管蛋白，并利用荧光淬灭的方法测定了融合蛋白和药剂结合的活性。
1 材料与方法
1．1材料
1.1.1 供试菌株、质粒及宿主菌
本研究所用菌株，质粒见表1，均为本室所存。
表1 本文中所用到的菌株、质粒及引物
菌株
Strains
特性及用途
Characterization and usage
BL21（DE3）
General E.coli purpose expression host
质粒
Plasmid
融合标签
Fusion tag
大小（千道尔顿）
Size（kDa）
克隆引物
Primers for cloning
pMALc2x
MBP
43
P3/P4
引物Primers
序列Sequence（5’3’）
注释Comment
P3
GCTCTAGAATGCGTGAGATTGTCCAC
XbalⅠ
P4
CCCAAGCTTCTAACCCTCGTACTCCTCGGGC
Hind Ш
1.1.2 主要试剂
98%多菌灵[N(2苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，methyl benzimidazol2yl carbendazim，MBC]原药由沈阳化工研究院提供；DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶、PrimerStar DNA聚合酶、dNTP，均购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；蛋白质分子量标准购自金斯瑞公司；异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）、丙烯酰胺、NN亚甲基双丙烯酰胺，购自上海生工生物工程技术服务有限公司（上海生工）；HisTrapTM HP Columns 1ml和5ml Columns购自GE Healthcare公司；质粒小提、DNA 凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；鼠抗His标签单抗购自上海Abmart生物技术有限公司；碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG，购自Sigma；其它试剂均为国产或进口分析纯。
1．2方法
1.2.1 引物的设计与合成
依据哈佛麻省理工Broad研究所（http://www.broadinstitute.org/）公布的禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因序列（FGSG_06611.3）以及各载体上的酶切位点设计引物，上游F2：5′GCTCTAGAATGCGTGAGATTGTCCAC3′,划线处为XbalⅠ酶切位点，下游R2: 5′CCCAAGCTTCTAACCCTCGTACTCCTCGGGC3′，划线处为HindⅢ的酶切位点，引物由上海生工合成，采用PAGE方法进行纯化。
1.2.2原核表达载体构建
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1供试菌株、质粒及宿主菌2
1.1.2主要试剂 2
1.2方法 2
1.2.1引物的设计与合成2
1.2.2原核表达载体构建3
1.2.3融合蛋白的诱导表达及纯化3
1.2.4 Western blot分析4
1.2.5 融合标签的切除 5
1.2.6 药剂结合 5
2结果分析 6
2.1 RTPCR 扩增结果 6
2.2 阳性重组质粒验证 6
2.3重组蛋白的纯化与可溶性表达 7
2.4 重组蛋白的酶切 7
2.5 药剂互作 8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
禾谷镰孢菌β2微管蛋白的原核表达以及药剂结合
引言
小
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
麦赤霉病 (Fusarium head blight of wheat) 是中国小麦最重要的病害之一。其病原菌的无性态为禾谷镰孢菌( Fusarium graminearum Schw )，有性态为玉蜀黍赤霉[Gibberella zeae (Schew.), Retch][1]。目前在国内小麦赤霉病综合防治体系中，使用苯并咪唑类（如多菌灵）杀菌剂是防治这种病害流行最常用、最有效的措施。但是，病原菌对这类杀菌剂易发生高水平抗药性突变，在杀菌剂高选择压力下会迅速形成抗药性群体[23]。随着抗性群体的扩大，常常造成药剂防治突然失效，造成产量严重损失。
苯并咪唑类杀菌剂的作用机制主要是通过与病原菌的β微管蛋白结合, 阻止β微管蛋白与α微管蛋白组装成微管, 导致纺锤体不能形成, 进而阻止真菌细胞的有丝分裂。大量研究表明，许多真菌对多菌灵的抗药性机制是β 微管蛋白基因发生点突变，造成蛋白的三维构象发生改变，导致药剂与靶标的亲和性下降或丧失。田间抗药性菌株的突变位点一般位于β2 微管蛋白167、198或200位氨基酸，198位氨基酸突变（198Glu→Ala）表现为乙霉威和N苯氨基甲酸酯类杀菌剂的负交互抗性[46]。
周明国研究小组根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum) 对多菌灵(MBC)敏感和抗药性菌株的细胞毒理学观察，发现MBCR菌株的β1微管蛋白基因（β1tub）未发生任何位点的突变，而是β2 微管蛋白（β2tub）的167、198或200位氨基酸发生突变，说明F. graminearum 对MBC的抗药性机制与其他丝状真菌不同[7]。目前因为微管蛋白在丝状真菌组织中的丰度很低，直接制备有很大困难[8]。为了客服这些困难得到大量高纯度的活性微管蛋白，本文采用MBP融合标签结合BL21（DE3）表达宿主菌来异源表达禾谷镰孢菌的β2微管蛋白，并利用荧光淬灭的方法测定了融合蛋白和药剂结合的活性。
1 材料与方法
1．1材料
1.1.1 供试菌株、质粒及宿主菌
本研究所用菌株，质粒见表1，均为本室所存。
表1 本文中所用到的菌株、质粒及引物
菌株
Strains
特性及用途
Characterization and usage
BL21（DE3）
General E.coli purpose expression host
质粒
Plasmid
融合标签
Fusion tag
大小（千道尔顿）
Size（kDa）
克隆引物
Primers for cloning
pMALc2x
MBP
43
P3/P4
引物Primers
序列Sequence（5’3’）
注释Comment
P3
GCTCTAGAATGCGTGAGATTGTCCAC
XbalⅠ
P4
CCCAAGCTTCTAACCCTCGTACTCCTCGGGC
Hind Ш
1.1.2 主要试剂
98%多菌灵[N(2苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，methyl benzimidazol2yl carbendazim，MBC]原药由沈阳化工研究院提供；DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶、PrimerStar DNA聚合酶、dNTP，均购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；蛋白质分子量标准购自金斯瑞公司；异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）、丙烯酰胺、NN亚甲基双丙烯酰胺，购自上海生工生物工程技术服务有限公司（上海生工）；HisTrapTM HP Columns 1ml和5ml Columns购自GE Healthcare公司；质粒小提、DNA 凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；鼠抗His标签单抗购自上海Abmart生物技术有限公司；碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG，购自Sigma；其它试剂均为国产或进口分析纯。
1．2方法
1.2.1 引物的设计与合成
依据哈佛麻省理工Broad研究所（http://www.broadinstitute.org/）公布的禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因序列（FGSG_06611.3）以及各载体上的酶切位点设计引物，上游F2：5′GCTCTAGAATGCGTGAGATTGTCCAC3′,划线处为XbalⅠ酶切位点，下游R2: 5′CCCAAGCTTCTAACCCTCGTACTCCTCGGGC3′，划线处为HindⅢ的酶切位点，引物由上海生工合成，采用PAGE方法进行纯化。
1.2.2原核表达载体构建
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