大豆疫霉rxlr效应分子avh23在大豆疫霉侵染寄主过程中的功能研究(附件)
大豆疫霉(Phytophthora sojae)隶属茸鞭生物界卵菌门疫霉属，能引起引起大豆根茎腐病。大豆疫霉在侵染寄主过程中，病原菌能分泌大量的效应分子来破坏或干扰其防卫反应，以促进自身的侵染定殖。大豆疫霉基因组编码了将近400 多个含有RxLR motif 的效应蛋白，本研究选取了在休止孢萌发阶段上调表达的一个效应分子Avh23作为研究对象，在大豆和烟草系统上表达，证明了Avh23 PsAvh23有促侵染功能。在大豆基因库中进行酵母筛库寻找PsAvh23在大豆细胞中的靶标蛋白，为进一步解释PsAvh23对病原菌的促侵染功能提供了一定的依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1 材料与方法3
1.1 供试材料3
1.1.1 菌株材料3
1.1.2 植物材料3
1.2 目的基因在烟草中瞬时表达3
1.2.1 Avh23基因的克隆 3
1.2.2 Avh23重组质粒构建3
1.2.3 大肠杆菌转化4
1.2.3.1大肠杆菌JM109感受态制备4
1.2.3.2 热击法转化大肠杆菌4
1.2.4 大肠杆菌质粒提取5
1.2.5 农杆菌转化5
1.2.5.1 农杆菌GV3101感受态制备5
1.2.5.2 电击法转化农杆菌5
1.2.6 注射烟草6
1.2.6.1 农杆菌悬浮缓冲液的配制6
1.2.6.2 农杆菌悬浮缓冲液洗农杆菌6
1.2.6.3 烟草叶片注射6
1.3 Avh23亚细胞定位及Western验证6
1.3.1 Avh23亚细胞定位6
1.3.2 Western验证蛋白表达6
1.3.2.1植物蛋白提取6
1.3.2.2 蛋白电泳及Western验证6
1.4辣椒疫霉侵染烟草实验 7
1.4.1 辣椒疫霉的培养7
1.4.2 辣椒疫霉侵染烟草7
1.5 农杆菌K599 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
介导的大豆毛状根(Hairy root）转化7
1.5.1 获取大豆子叶7
1.5.2 接种菌体7
1.5.3 观察毛状根的荧光情况8
1.5.4 发荧光根毛总蛋白的提取及Western检测8
1.6大豆疫霉侵染大豆根毛 8
1.7酵母筛库8
1.7.1筛选用菌株及载体8
1.7.2 常用培养基8
1.7.3 酵母感受态制备和转化9
1.7.4 大豆cDNA文库的筛选9
1.8CoIP体内验证蛋白互作10
1.8.1相关蛋白表达载体构建10
1.8.2 CoIP实验步骤 10
2 结果与分析10
2.1大豆疫霉效应分子Avh23的多态性分析10
2.2 PsAvh23能够促进病原菌在寄主上的侵染11
2.2.1 烟草过表达PsAvh23致使辣椒疫霉侵染力增强11
2.2.2 大豆过表达PsAvh致使大豆疫霉侵染力增强12
2.3 Avh23定位在烟草细胞的细胞膜和细胞核内12
2.4酵母双杂交筛选Avh23互作蛋白13
2.5 Avh23和GmAda2全长酵母互作验证13
2.6 CoIP蛋白体内互作验证14
2.7 Ada2在不同物种中的同源性和保守结构域分析14
2.8 PsAvh23能与多种植物中的Ada2在酵母体内互作15
3 讨论 16
致谢17
参考文献17
附录19
大豆疫霉RxRL效应分子Avh23在大豆疫霉
侵染寄主过程中的功能研究
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae)是一类半活体营养的病原卵菌，大豆疫霉在苗期造成猝倒，成株期造成根腐和茎腐。大豆对大豆疫霉菌的抗性为小种专化性抗性，大豆品种间有明显的抗感差异，品种的感病性是导致大豆疫霉根腐病发生的主要因素之一。 在大豆疫霉和大豆相互进化的过程中必然存在无毒基因和抗病基因的相互识别，因此，使用含抗病基因的大豆抗病品种是控制大豆疫病的有效措施之一。同绝大多数动植物病原菌一样，植物病原卵菌在与寄主植物互作的过程中，也会分泌效应蛋白(effectors)进入寄主细胞中，通过破坏或者干扰细胞代谢途径，从而促进自身的侵入和繁殖。
通过生物信息学分析发现，在P. sojae, P. ramorum和P. infestans的基因组中广泛分布着大量编码具有无毒基因类似结构泌出蛋白的基因，即N端具有信号肽和紧随其后的RxLRdEER motif，以及在其C端具有W/Y/L motif ，故被称作Avr homology genes（Avh）基因，大豆疫霉基因组中有400多个的Avh基因[1]，然而对于这些效应分子在致病过程中所起的作用仍然所知甚少。目前对无毒基因的功能研究发现这些效应分子与抑制植物免疫系统有关。
本实验室之前对于大豆疫霉效应分子功能的大规模筛选结果，挑选出了15 个RxLR 效应分子进行进一步分析。通过Solexa 数据库对这些效应分子转录水平进行分析，发现有几个效应分子通过Solexa 检测不到表达，其余的都在侵染初期有不同程度的上调表达，其中Avh23、Avh94、Avh181 和Avr3b在休止孢萌发阶段上调表达，这表明这些效应分子在病原菌侵染寄主的过程中可能有重要的作用。研究发现效应分子保守的RxLR功能域可以与寄主细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内。并且一系列实验证实效应分子进入植物细胞内可以不依赖病原物的存在[2]。 因此可以在植物细胞中单独过表达病原物效应分子来模拟侵染阶段中病原物加速分泌效应分子的过程。利用马铃薯病毒（Potato Virus X,PVX）表达系统在烟草中进行功能分析。病毒载体能够高效表达外源基因并利用植物细胞内的机制正确折叠外源蛋白,为高等真核生物提供了一个可以检测的实验系统。
发根农杆菌（Agrobacterium rhiogenes）K599隶属于土壤杆菌属，它侵染一些双子叶植物外植体能诱导产生毛状根。发根农杆菌同根癌农杆菌一样，均能引导TDNA穿过农杆菌的细胞膜进入宿主细胞的细胞核，进而使TDNA整合到植物基因组中，都可以作为一种有效的植物基因转化体系。徐纪明等 [3]构建的pBIN35SGFP外源表达质粒，转入发根农杆菌K599用于侵染植物外植体形成转基因不定根，不定根能在蓝色激发光下发出强烈的绿色荧光，表明基因能在转基因不定根中高效表达，用于转基因不定根的快速鉴定。毛状根可以作为研究作物根部病虫害病理的良好材料，Hyeond等[4]构建了发根农杆菌K599双元质粒表达载体，含有pBI121和pBINmgfpER，载体上含有nptⅡ. gus和gfp标记基因，并以大豆子叶作为外植体进行转化，获得毛状根繁殖之后接种大豆根结线虫，此体系的建立用于大豆根结线虫抗性基因的选择。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1 材料与方法3
1.1 供试材料3
1.1.1 菌株材料3
1.1.2 植物材料3
1.2 目的基因在烟草中瞬时表达3
1.2.1 Avh23基因的克隆 3
1.2.2 Avh23重组质粒构建3
1.2.3 大肠杆菌转化4
1.2.3.1大肠杆菌JM109感受态制备4
1.2.3.2 热击法转化大肠杆菌4
1.2.4 大肠杆菌质粒提取5
1.2.5 农杆菌转化5
1.2.5.1 农杆菌GV3101感受态制备5
1.2.5.2 电击法转化农杆菌5
1.2.6 注射烟草6
1.2.6.1 农杆菌悬浮缓冲液的配制6
1.2.6.2 农杆菌悬浮缓冲液洗农杆菌6
1.2.6.3 烟草叶片注射6
1.3 Avh23亚细胞定位及Western验证6
1.3.1 Avh23亚细胞定位6
1.3.2 Western验证蛋白表达6
1.3.2.1植物蛋白提取6
1.3.2.2 蛋白电泳及Western验证6
1.4辣椒疫霉侵染烟草实验 7
1.4.1 辣椒疫霉的培养7
1.4.2 辣椒疫霉侵染烟草7
1.5 农杆菌K599 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
介导的大豆毛状根(Hairy root）转化7
1.5.1 获取大豆子叶7
1.5.2 接种菌体7
1.5.3 观察毛状根的荧光情况8
1.5.4 发荧光根毛总蛋白的提取及Western检测8
1.6大豆疫霉侵染大豆根毛 8
1.7酵母筛库8
1.7.1筛选用菌株及载体8
1.7.2 常用培养基8
1.7.3 酵母感受态制备和转化9
1.7.4 大豆cDNA文库的筛选9
1.8CoIP体内验证蛋白互作10
1.8.1相关蛋白表达载体构建10
1.8.2 CoIP实验步骤 10
2 结果与分析10
2.1大豆疫霉效应分子Avh23的多态性分析10
2.2 PsAvh23能够促进病原菌在寄主上的侵染11
2.2.1 烟草过表达PsAvh23致使辣椒疫霉侵染力增强11
2.2.2 大豆过表达PsAvh致使大豆疫霉侵染力增强12
2.3 Avh23定位在烟草细胞的细胞膜和细胞核内12
2.4酵母双杂交筛选Avh23互作蛋白13
2.5 Avh23和GmAda2全长酵母互作验证13
2.6 CoIP蛋白体内互作验证14
2.7 Ada2在不同物种中的同源性和保守结构域分析14
2.8 PsAvh23能与多种植物中的Ada2在酵母体内互作15
3 讨论 16
致谢17
参考文献17
附录19
大豆疫霉RxRL效应分子Avh23在大豆疫霉
侵染寄主过程中的功能研究
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae)是一类半活体营养的病原卵菌，大豆疫霉在苗期造成猝倒，成株期造成根腐和茎腐。大豆对大豆疫霉菌的抗性为小种专化性抗性，大豆品种间有明显的抗感差异，品种的感病性是导致大豆疫霉根腐病发生的主要因素之一。 在大豆疫霉和大豆相互进化的过程中必然存在无毒基因和抗病基因的相互识别，因此，使用含抗病基因的大豆抗病品种是控制大豆疫病的有效措施之一。同绝大多数动植物病原菌一样，植物病原卵菌在与寄主植物互作的过程中，也会分泌效应蛋白(effectors)进入寄主细胞中，通过破坏或者干扰细胞代谢途径，从而促进自身的侵入和繁殖。
通过生物信息学分析发现，在P. sojae, P. ramorum和P. infestans的基因组中广泛分布着大量编码具有无毒基因类似结构泌出蛋白的基因，即N端具有信号肽和紧随其后的RxLRdEER motif，以及在其C端具有W/Y/L motif ，故被称作Avr homology genes（Avh）基因，大豆疫霉基因组中有400多个的Avh基因[1]，然而对于这些效应分子在致病过程中所起的作用仍然所知甚少。目前对无毒基因的功能研究发现这些效应分子与抑制植物免疫系统有关。
本实验室之前对于大豆疫霉效应分子功能的大规模筛选结果，挑选出了15 个RxLR 效应分子进行进一步分析。通过Solexa 数据库对这些效应分子转录水平进行分析，发现有几个效应分子通过Solexa 检测不到表达，其余的都在侵染初期有不同程度的上调表达，其中Avh23、Avh94、Avh181 和Avr3b在休止孢萌发阶段上调表达，这表明这些效应分子在病原菌侵染寄主的过程中可能有重要的作用。研究发现效应分子保守的RxLR功能域可以与寄主细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内。并且一系列实验证实效应分子进入植物细胞内可以不依赖病原物的存在[2]。 因此可以在植物细胞中单独过表达病原物效应分子来模拟侵染阶段中病原物加速分泌效应分子的过程。利用马铃薯病毒（Potato Virus X,PVX）表达系统在烟草中进行功能分析。病毒载体能够高效表达外源基因并利用植物细胞内的机制正确折叠外源蛋白,为高等真核生物提供了一个可以检测的实验系统。
发根农杆菌（Agrobacterium rhiogenes）K599隶属于土壤杆菌属，它侵染一些双子叶植物外植体能诱导产生毛状根。发根农杆菌同根癌农杆菌一样，均能引导TDNA穿过农杆菌的细胞膜进入宿主细胞的细胞核，进而使TDNA整合到植物基因组中，都可以作为一种有效的植物基因转化体系。徐纪明等 [3]构建的pBIN35SGFP外源表达质粒，转入发根农杆菌K599用于侵染植物外植体形成转基因不定根，不定根能在蓝色激发光下发出强烈的绿色荧光，表明基因能在转基因不定根中高效表达，用于转基因不定根的快速鉴定。毛状根可以作为研究作物根部病虫害病理的良好材料，Hyeond等[4]构建了发根农杆菌K599双元质粒表达载体，含有pBI121和pBINmgfpER，载体上含有nptⅡ. gus和gfp标记基因，并以大豆子叶作为外植体进行转化，获得毛状根繁殖之后接种大豆根结线虫，此体系的建立用于大豆根结线虫抗性基因的选择。
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