大豆疫霉菌中富含半胱氨酸小分泌蛋白的预测及分析
大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一,每年导致全球高达十几亿美元的直接经济损失(Tyler et al. 2006)。本研究基于大豆疫霉的全基因组序列，结合计算机技术和生物信息学的方法，对大豆疫霉的富含半胱氨酸小分泌蛋白进行了系统的分析。首先预测其包含的所有富含半胱氨酸小分泌蛋白，然后系统地研究其信号肽、氨基酸组成和内含子等的序列特征、功能分类、转录表达模式等，深入了解这类分泌蛋白的作用模式及其与植物免疫反应的关系，为大豆疫霉的致病机理研究提供新的思路，同时也对解析疫霉与植物互作的分子基础及病害成灾的机制具有一定的理论和实践意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法3
2结果3
2.1 SSCP的预测3
2.2 信号肽特征分析3
2.2.1 信号肽长度分析3
2.2.2 信号肽的氨基酸组成4
2.2.3信号肽与成熟蛋白切割位点3位~+3位的氨基酸数量分布4
2.3 SSCP的氨基酸组成6
2.2 内含子分析6
2.4.1内含子数量分析6
2.4.2 内含子长度分析6
2.4.3 SSCP与SP内含子比较7
3 SSCP的功能预测分析7
3.1 功能注释7
3.2 家族分类功能分析8
4 结论 10
致谢 12
参考文献 13 大豆疫霉菌中富含半胱氨酸小分泌蛋白的
预测及分析
引言
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae)属卵菌门疫霉属。大豆疫霉菌为土传病原菌，易在有水沉积或湿度很大的土壤中引发大豆根腐病。与樟疫霉、寄生疫霉和橡树疫霉等疫霉菌的寄主范围较广不同，大豆疫霉菌寄主范围窄，只侵染大豆，为专性半活体营养型病原菌[1]。该病原菌主要通过土壤、病残体及种子表皮内的卵孢子进行传播。大豆疫霉的初侵染源为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
能够抵御不良环境的卵孢子；卵孢子在土壤和发病寄主残体中存活并完成越冬过程，并在翌年适宜的环境下萌发形成孢子囊；孢子囊通过原生质体的割裂形成并释放接种体游动孢子，随即开始对寄主进行侵染[2]。卵孢子在植株残体和土壤内能存活多年，休眠卵孢子能在休闲病田中存活长达4 年[3]。但病原菌的菌丝、游动孢子囊和游动孢子均不能在低温下（3℃以下）存活。大豆疫霉菌最适生长温度为24~28℃，最高为35℃。在保证湿度的条件下，温度高于30℃时，大豆疫霉菌的毒性显著增强[4]。
图1：大豆疫霉的生活史循环
大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，是我国重要的对外检疫对象[5]，每年导致全球高达十几亿美元的直接经济损失。大豆根腐病主要危害大豆根系，使大豆植株根部酶或其他类物质的活性、数量受到不同程度影响，从而减弱植株根系对土壤中水分和养分的吸收，使大豆减产10%~60%，严重时甚至绝产[6]。在中国大豆主产区黑龙江、安徽、福建等地都有大豆根腐病的发生，其中以黑龙江省东北部地区发生最重[7]。所以有效的控制大豆疫霉病的发生和扩展成为研究者的主要任务。
目前的研究发现，病原菌在侵染植物的过程中，会持续不断地向寄主植物中释放分泌蛋白以利于病原菌侵染植物并在植物中定殖和扩展[8]。这些分泌蛋白可与寄主细胞中的相关蛋白互作引发寄主一系列与病害发展相关的生理生化反应并最终形成病害。有的分泌蛋白作为效应物参与侵染寄主过程，可以降解植物表皮组织及细胞壁，以利于病原菌穿透植物表皮层；有的作为毒力因子或者毒素改变寄主细胞的结构或者功能[9]，或者作为无毒因子或者激发子引发寄主防卫反应，干扰或打断植物 PTI 反应，使得病原菌可以在植物组织内生长繁殖[10]。
近年来，随着基因组学、比较生物组学、生物信息学的发展,以及生物基因组测序的完成可为基因功能的研究提供大量的基因组信息。一系列卵菌例如大豆疫霉(P. sojae)、橡树疫霉(P. ramorum) [11]和致病疫霉(P. infestans) [12]等的全基因组序列测序完成并公布，使得能够借助生物信息学工具从序列水平进行系统的研究，对卵菌的研究起了极大地推动作用。如对蛋白质的结构和功能的预测,包括蛋白的信号肽预测、作用位点的预测、跨膜结构的预测和亚细胞位点的预测等,已成为生物信息学研究的重要组成部分,也可为今后的试验提供更可靠的依据[13]。
1 材料和方法
1.1 材料
大豆疫霉（P. sojae）的基因组序列从JGI数据库（DOE Joint Genome Institute, http://genome.jgipsf.org/Physo1_1/Physo1_1.download.ftp.html）(Tyler et al., 2006)获取。
1.2 方法
利用SingalP3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP3.0/）软件分析大豆疫霉菌全基因组编码的蛋白序列中是否具有信号肽以及该信号肽的切割位点，TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）软件对该序列的跨膜区进行分析，TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）软件预测蛋白在亚细胞器中的分布和定位，基于以上三个分析软件预测得到大豆疫霉编码的所有分泌蛋白，随后通过氨基酸数量小于等于300和半胱氨酸数量大于等于4个的条件筛选，得到大豆疫霉编码的富含半胱氨酸的小分泌蛋白（small secreted cysteinerich protein, SSCP）。
在得到SSCP后，对由SingalP3.0软件分析得到的信号肽结果通过Excel进行信号肽长度、氨基酸组成以及信号肽与成熟蛋白切割位点3位~+3位的氨基酸数量的分析。同时也分析了SSCP的氨基酸组成和内含子长度和数量。
基于蛋白序列相似性，利用TribeMCL软件将SSCP聚类分成不同的家族，同时通过Blast2go软件将SSCP序列Blast比对NCBI上收录的非冗余蛋白库进行功能注释，又通过pfam软件对SSCP的功能结构域进行了分析，之后对这三个结果进行比较，得出已有功能注释的基因家族以及还没有明确功能的基因家族。
2 结果
2.1 SSCP的预测
采用信号肽预测软件SingalP3.0对大豆疫霉全基因组19027个基因进行预测，其中有2679个基因含有信号肽，通过TMHMM对2679个含有信号肽的基因进行筛选得出2073个基因无跨膜区，之后利用TargetP软件对2073个无跨膜区的基因进行定位预测得到1781个分泌蛋白，最后按照氨基酸数量小于等于300、半胱氨酸数量大于等于4个的条件筛选得到SSCP共430个（图2）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法3
2结果3
2.1 SSCP的预测3
2.2 信号肽特征分析3
2.2.1 信号肽长度分析3
2.2.2 信号肽的氨基酸组成4
2.2.3信号肽与成熟蛋白切割位点3位~+3位的氨基酸数量分布4
2.3 SSCP的氨基酸组成6
2.2 内含子分析6
2.4.1内含子数量分析6
2.4.2 内含子长度分析6
2.4.3 SSCP与SP内含子比较7
3 SSCP的功能预测分析7
3.1 功能注释7
3.2 家族分类功能分析8
4 结论 10
致谢 12
参考文献 13 大豆疫霉菌中富含半胱氨酸小分泌蛋白的
预测及分析
引言
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae)属卵菌门疫霉属。大豆疫霉菌为土传病原菌，易在有水沉积或湿度很大的土壤中引发大豆根腐病。与樟疫霉、寄生疫霉和橡树疫霉等疫霉菌的寄主范围较广不同，大豆疫霉菌寄主范围窄，只侵染大豆，为专性半活体营养型病原菌[1]。该病原菌主要通过土壤、病残体及种子表皮内的卵孢子进行传播。大豆疫霉的初侵染源为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
能够抵御不良环境的卵孢子；卵孢子在土壤和发病寄主残体中存活并完成越冬过程，并在翌年适宜的环境下萌发形成孢子囊；孢子囊通过原生质体的割裂形成并释放接种体游动孢子，随即开始对寄主进行侵染[2]。卵孢子在植株残体和土壤内能存活多年，休眠卵孢子能在休闲病田中存活长达4 年[3]。但病原菌的菌丝、游动孢子囊和游动孢子均不能在低温下（3℃以下）存活。大豆疫霉菌最适生长温度为24~28℃，最高为35℃。在保证湿度的条件下，温度高于30℃时，大豆疫霉菌的毒性显著增强[4]。
图1：大豆疫霉的生活史循环
大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，是我国重要的对外检疫对象[5]，每年导致全球高达十几亿美元的直接经济损失。大豆根腐病主要危害大豆根系，使大豆植株根部酶或其他类物质的活性、数量受到不同程度影响，从而减弱植株根系对土壤中水分和养分的吸收，使大豆减产10%~60%，严重时甚至绝产[6]。在中国大豆主产区黑龙江、安徽、福建等地都有大豆根腐病的发生，其中以黑龙江省东北部地区发生最重[7]。所以有效的控制大豆疫霉病的发生和扩展成为研究者的主要任务。
目前的研究发现，病原菌在侵染植物的过程中，会持续不断地向寄主植物中释放分泌蛋白以利于病原菌侵染植物并在植物中定殖和扩展[8]。这些分泌蛋白可与寄主细胞中的相关蛋白互作引发寄主一系列与病害发展相关的生理生化反应并最终形成病害。有的分泌蛋白作为效应物参与侵染寄主过程，可以降解植物表皮组织及细胞壁，以利于病原菌穿透植物表皮层；有的作为毒力因子或者毒素改变寄主细胞的结构或者功能[9]，或者作为无毒因子或者激发子引发寄主防卫反应，干扰或打断植物 PTI 反应，使得病原菌可以在植物组织内生长繁殖[10]。
近年来，随着基因组学、比较生物组学、生物信息学的发展,以及生物基因组测序的完成可为基因功能的研究提供大量的基因组信息。一系列卵菌例如大豆疫霉(P. sojae)、橡树疫霉(P. ramorum) [11]和致病疫霉(P. infestans) [12]等的全基因组序列测序完成并公布，使得能够借助生物信息学工具从序列水平进行系统的研究，对卵菌的研究起了极大地推动作用。如对蛋白质的结构和功能的预测,包括蛋白的信号肽预测、作用位点的预测、跨膜结构的预测和亚细胞位点的预测等,已成为生物信息学研究的重要组成部分,也可为今后的试验提供更可靠的依据[13]。
1 材料和方法
1.1 材料
大豆疫霉（P. sojae）的基因组序列从JGI数据库（DOE Joint Genome Institute, http://genome.jgipsf.org/Physo1_1/Physo1_1.download.ftp.html）(Tyler et al., 2006)获取。
1.2 方法
利用SingalP3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP3.0/）软件分析大豆疫霉菌全基因组编码的蛋白序列中是否具有信号肽以及该信号肽的切割位点，TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）软件对该序列的跨膜区进行分析，TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）软件预测蛋白在亚细胞器中的分布和定位，基于以上三个分析软件预测得到大豆疫霉编码的所有分泌蛋白，随后通过氨基酸数量小于等于300和半胱氨酸数量大于等于4个的条件筛选，得到大豆疫霉编码的富含半胱氨酸的小分泌蛋白（small secreted cysteinerich protein, SSCP）。
在得到SSCP后，对由SingalP3.0软件分析得到的信号肽结果通过Excel进行信号肽长度、氨基酸组成以及信号肽与成熟蛋白切割位点3位~+3位的氨基酸数量的分析。同时也分析了SSCP的氨基酸组成和内含子长度和数量。
基于蛋白序列相似性，利用TribeMCL软件将SSCP聚类分成不同的家族，同时通过Blast2go软件将SSCP序列Blast比对NCBI上收录的非冗余蛋白库进行功能注释，又通过pfam软件对SSCP的功能结构域进行了分析，之后对这三个结果进行比较，得出已有功能注释的基因家族以及还没有明确功能的基因家族。
2 结果
2.1 SSCP的预测
采用信号肽预测软件SingalP3.0对大豆疫霉全基因组19027个基因进行预测，其中有2679个基因含有信号肽，通过TMHMM对2679个含有信号肽的基因进行筛选得出2073个基因无跨膜区，之后利用TargetP软件对2073个无跨膜区的基因进行定位预测得到1781个分泌蛋白，最后按照氨基酸数量小于等于300、半胱氨酸数量大于等于4个的条件筛选得到SSCP共430个（图2）。
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