大豆短叶柄突变体dsp的遗传与基因定位研究(附件)
利用一个新发现的短叶柄突变体DSP与长叶柄品种南农1138-2配制的杂交组合进行短叶柄性状遗传与定位研究。该组合F1表现长叶柄，F2分离群体中，正常和短叶柄植株分离比符合3:1的表型分离比例，推测该短叶柄性状受一对隐性基因控制。分别选取正常与短叶柄单株各12株叶片DNA进行混池，构建显、隐基因池，利用1015个SSR引物对基因池进行了多态标记筛选，发现5个标记存在明显的多态。对93株隐性单株进行基因型分析，进一步利用Mapmaker软件将短叶柄基因初定位于7号染色体的长臂上，突变基因与Satt150、Satt567标记间的距离分别为11.6cM和3.1cM。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1突变体遗传分析与籽粒性状鉴定 2
1.2.2 DNA提取方法 2
1.2.2.1主要试剂 2
1.2.2.2 DNA提取步骤 2
1.2.3 SSR分子标记分析 3
1.2.3.1 PCR扩增 3
1.2.3.2聚丙烯酰氨凝胶电泳 3
1.2.3.3银染与显色3
1.2.4利用SSR分子标记初定位突变基因3
2 结果与分析4
2.1短叶柄形状的划分标准4
2.2短叶柄突变体与野生型籽粒性状差异分析4
2.3 DSP短叶柄的遗传分析4
2.4运用SSR标记进行遗传定位5
3讨论5
致谢6
参考文献6
大豆短叶柄突变体DSP的遗传与基因定位研究
引言
引言
株型改良是大豆高产育种的重要方向，许多研究者从提高群体光能利用效率的角度提出了各种大豆高产理想株型型的形态、生理特性（董钻，1988；杜维广等，2014）。植物叶片是光合作用和同化作用的主要部位，叶形态是植株株型的重要组成，深入研究叶发育分子机理具有重要的理论意义和应用价值。叶柄是连接茎和叶片的器官,关系到叶片角度与植株冠层
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
结构，同时，在光合产物的运输和贮藏等方面也具有重要作用。徐元章和刘宝发现，大豆叶柄长度、直径、比叶柄重的最大值一般出现在植株的中上部节，且品种间的叶柄长度变化比较大。徐克章等（1988）发现大豆叶柄长度、直径、比叶柄重的最大值出现在植株的中上部节，品种间叶柄长度变化较大。
简单重复序列 (Simple Sequence Repeats，SSR)是一类在基因组中由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长约几十个核苷酸的串联重复序列，是以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA。Akkaya等（1995）的早期研究已经证实了大豆SSRs表现出高水平的多态性。吴晓雷等（2001）应用RFLP、SSR、AFLP和RAPD等四种分子标记进行亲本间的多态性分析，结果表明多态性最高的是SSR标记，为59.7％。Cregan等（1999）利用广泛地分布于大豆基因组的SSR标记构建了大豆整合图谱。SSR等标记已广泛用于构建大豆高密度的分子遗传图谱，并用于比较基因组研究、基因图位克隆、数量性状位点定位、分子标记辅助选择等方面。
短叶柄可能在提高群体密度、改良株型上有利，合理培育能够获得高产抗倒的大豆新品种，因此短叶柄突变体具有一定的研究价值，但目前这方面报道较少。Kilen（1983）发现一个短叶柄材料D761609，其与长叶柄亲本Lee68杂交后代分离结果表明短叶柄性状受一对隐性基因控制，命名为lps；田佩占也发现一个短叶柄材料，遗传分析结果表明受一对隐性基因控制，同时还有微效基因作用。赵团结等（1998）指出短叶柄性状受至少4对基因的复杂基因系统控制。不同基因的利用价值可能不同，定位大豆短叶柄基因，一方面将有助于揭示短叶柄基因遗传调控规律，同时也为大豆育种等研究提供新的材料和基因。本研究拟在对新发现的大豆短叶柄突变体DSP进行特性调查基础上，利用SSR标记进行基因定位研究，以期为今后相关研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的材料由国家大豆改良中心提供。突变体DSP是从南农菜豆5号与野生大豆ZYD4219杂交后代中分离出的短叶柄突变体材料，经过多代自交已到F7代，短叶柄表现稳定。南农11382是由大学选育出的综合性状优良的品种。2013年以南农11382为母本，突变体材料为父本进行杂交。收获的F1代在海南繁种基地进行种植。2014年4月，在南京江浦实验基地进行种植。行长1.8m，行距0.5m，株距0.1m。
1.2方法
1.2.1突变体遗传分析与籽粒性状测定
开花期对南农11382×DSP的F1、F2代植株进行挂牌，根据亲本叶柄形态为依据，多次调查植株表型，将其分为正常型和突变型两种类型。采用卡方适合性检验对F2群体正常型与突变型的分离比例进行分析。公式如下：
上式中以O表示观察次数，E表示理论次数。
对DSP正常型种子和突变体种子进行百粒重和油分、蛋白质含量的调查，品质性状利用近红外谷物分析测定。采用t测验进行差异显著性分析。
1.2.2 DNA提取方法
1.2.2.1 主要试剂
1）2×CTAB（pH=8.0）缓冲液：20 mmol/L EDTA（pH=8.0），100 mmol/L TrisHCl（pH=8.0），2% CTAB，1.4mol/L NaCl，配置完成后置于高温高压灭菌锅中进行灭菌，常温备用。
2）1×TE（pH=8.0）缓冲液：1 mmol/L EDTA（pH=8.0），10 mmol/L TrisHCl（pH=8.0），配置完成后置于高温高压灭菌锅中进行灭菌，常温备用。
3）3M NaAc（pH=5.2）：40.8 g NaAc﹒3H2O，40 mL ddH2O，用冰醋酸调节，定容（100mL），配置完成后置于高温高压灭菌锅中进行灭菌，常温备用。
4）氯仿/异戊醇（24：1）：20 mL异戊醇与480 mL氯仿均匀混合。
5）70%乙醇：350 mL乙醇，用ddH2O定容至500 mL。
1.2.2.2 DNA提取步骤
基因组DNA的提取采用改良CTAB法，具体步骤为：
1）取适量新鲜的大豆植株嫩叶，取样过多影响DNA提取效果。
2）一边往研钵中添加液氮，一边迅速研样，待叶片研磨呈发白的粉末后装于1.5ml离心管中。
3）加入800μl提前预热好的提取缓冲液于离心管中，轻轻摇匀后置于65℃水浴锅中裂解50 min，在此期间轻摇34次。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1突变体遗传分析与籽粒性状鉴定 2
1.2.2 DNA提取方法 2
1.2.2.1主要试剂 2
1.2.2.2 DNA提取步骤 2
1.2.3 SSR分子标记分析 3
1.2.3.1 PCR扩增 3
1.2.3.2聚丙烯酰氨凝胶电泳 3
1.2.3.3银染与显色3
1.2.4利用SSR分子标记初定位突变基因3
2 结果与分析4
2.1短叶柄形状的划分标准4
2.2短叶柄突变体与野生型籽粒性状差异分析4
2.3 DSP短叶柄的遗传分析4
2.4运用SSR标记进行遗传定位5
3讨论5
致谢6
参考文献6
大豆短叶柄突变体DSP的遗传与基因定位研究
引言
引言
株型改良是大豆高产育种的重要方向，许多研究者从提高群体光能利用效率的角度提出了各种大豆高产理想株型型的形态、生理特性（董钻，1988；杜维广等，2014）。植物叶片是光合作用和同化作用的主要部位，叶形态是植株株型的重要组成，深入研究叶发育分子机理具有重要的理论意义和应用价值。叶柄是连接茎和叶片的器官,关系到叶片角度与植株冠层
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
结构，同时，在光合产物的运输和贮藏等方面也具有重要作用。徐元章和刘宝发现，大豆叶柄长度、直径、比叶柄重的最大值一般出现在植株的中上部节，且品种间的叶柄长度变化比较大。徐克章等（1988）发现大豆叶柄长度、直径、比叶柄重的最大值出现在植株的中上部节，品种间叶柄长度变化较大。
简单重复序列 (Simple Sequence Repeats，SSR)是一类在基因组中由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长约几十个核苷酸的串联重复序列，是以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA。Akkaya等（1995）的早期研究已经证实了大豆SSRs表现出高水平的多态性。吴晓雷等（2001）应用RFLP、SSR、AFLP和RAPD等四种分子标记进行亲本间的多态性分析，结果表明多态性最高的是SSR标记，为59.7％。Cregan等（1999）利用广泛地分布于大豆基因组的SSR标记构建了大豆整合图谱。SSR等标记已广泛用于构建大豆高密度的分子遗传图谱，并用于比较基因组研究、基因图位克隆、数量性状位点定位、分子标记辅助选择等方面。
短叶柄可能在提高群体密度、改良株型上有利，合理培育能够获得高产抗倒的大豆新品种，因此短叶柄突变体具有一定的研究价值，但目前这方面报道较少。Kilen（1983）发现一个短叶柄材料D761609，其与长叶柄亲本Lee68杂交后代分离结果表明短叶柄性状受一对隐性基因控制，命名为lps；田佩占也发现一个短叶柄材料，遗传分析结果表明受一对隐性基因控制，同时还有微效基因作用。赵团结等（1998）指出短叶柄性状受至少4对基因的复杂基因系统控制。不同基因的利用价值可能不同，定位大豆短叶柄基因，一方面将有助于揭示短叶柄基因遗传调控规律，同时也为大豆育种等研究提供新的材料和基因。本研究拟在对新发现的大豆短叶柄突变体DSP进行特性调查基础上，利用SSR标记进行基因定位研究，以期为今后相关研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的材料由国家大豆改良中心提供。突变体DSP是从南农菜豆5号与野生大豆ZYD4219杂交后代中分离出的短叶柄突变体材料，经过多代自交已到F7代，短叶柄表现稳定。南农11382是由大学选育出的综合性状优良的品种。2013年以南农11382为母本，突变体材料为父本进行杂交。收获的F1代在海南繁种基地进行种植。2014年4月，在南京江浦实验基地进行种植。行长1.8m，行距0.5m，株距0.1m。
1.2方法
1.2.1突变体遗传分析与籽粒性状测定
开花期对南农11382×DSP的F1、F2代植株进行挂牌，根据亲本叶柄形态为依据，多次调查植株表型，将其分为正常型和突变型两种类型。采用卡方适合性检验对F2群体正常型与突变型的分离比例进行分析。公式如下：
上式中以O表示观察次数，E表示理论次数。
对DSP正常型种子和突变体种子进行百粒重和油分、蛋白质含量的调查，品质性状利用近红外谷物分析测定。采用t测验进行差异显著性分析。
1.2.2 DNA提取方法
1.2.2.1 主要试剂
1）2×CTAB（pH=8.0）缓冲液：20 mmol/L EDTA（pH=8.0），100 mmol/L TrisHCl（pH=8.0），2% CTAB，1.4mol/L NaCl，配置完成后置于高温高压灭菌锅中进行灭菌，常温备用。
2）1×TE（pH=8.0）缓冲液：1 mmol/L EDTA（pH=8.0），10 mmol/L TrisHCl（pH=8.0），配置完成后置于高温高压灭菌锅中进行灭菌，常温备用。
3）3M NaAc（pH=5.2）：40.8 g NaAc﹒3H2O，40 mL ddH2O，用冰醋酸调节，定容（100mL），配置完成后置于高温高压灭菌锅中进行灭菌，常温备用。
4）氯仿/异戊醇（24：1）：20 mL异戊醇与480 mL氯仿均匀混合。
5）70%乙醇：350 mL乙醇，用ddH2O定容至500 mL。
1.2.2.2 DNA提取步骤
基因组DNA的提取采用改良CTAB法，具体步骤为：
1）取适量新鲜的大豆植株嫩叶，取样过多影响DNA提取效果。
2）一边往研钵中添加液氮，一边迅速研样，待叶片研磨呈发白的粉末后装于1.5ml离心管中。
3）加入800μl提前预热好的提取缓冲液于离心管中，轻轻摇匀后置于65℃水浴锅中裂解50 min，在此期间轻摇34次。
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