稻瘟病菌morgs7的互作蛋白的筛选
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是全球水稻生产上的毁灭性病害之一，每年平均造成10%-30%的产量损失，严重威胁全世界的粮食生产安全。目前，稻瘟病的防治措施主要以抗病品种和化学农药为主，但是由于稻瘟病菌易发生变异，新的致病小种的出现容易导致新选育的抗病品种失去利用价值。因此，迫切需要从分子水平解析病菌致病机理，从而为抗病育种提供新的策略，同时为新型杀菌剂的开发提供候选靶标。稻瘟病菌G蛋白信号转导途径参与调控稻瘟病菌生长发育、分生孢子产生、附着胞形成及致病过程。G蛋白信号调控因子（Regulators of G-protein signaling，RGS）作为G蛋白信号转导途径的负调控因子在稻瘟病菌的营养生长、无性/有性繁殖、附着胞分化、细胞壁完整性及致病过程中具有重要作用。为进一步阐明Rgs蛋白家族在稻瘟病菌中的致病分子机制，本文以Rgs7为诱饵进行免疫共沉淀（CO-IP）分析，两次结果中共有52个候选蛋白与MoRgs7存在潜在的互作关系。本研究通过酵母双杂方法对MGG_01873、MGG_02525与MoRgs7的互作关系进行了验证。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1基本材料3
1.1.1供试菌株与培养条件 3
1.1.2质粒载体 3
1.1.3主要抗生素和试剂 3
1.2常用培养基和溶液的配制 3
1.3实验方法 3
1.3.1coIP筛选互作蛋白3
1.3.1.1表达载体构建及原生质体转化 3
1.3.1.2表达菌株筛选及coIP4
1.3.1.3蛋白质谱测序 5
1.3.2稻瘟病菌总RNA的提取 5
1.3.3合成模板cDNA 5
1.3.4酵母双杂载体构建 5
1.3.4.1 PCR扩增 6
1.3.4.2 PCR产物回收 6
1.3.4.3 pGADT7、pGBDT7酶切线性化6
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MoRgs7质粒7
1.3.4.5感受态细胞制备及转化 7
1.3.4.6菌落PCR筛选阳性克隆 7
1.3.4.7质粒提取 7
1.3.4.8测序 8
1.3.5酵母双杂验证 8
2结果与分析 8
2.1D7TM MoRGS7 STag表达菌株的获得8
2.2免疫共沉淀分离与MoRgs7相互作用的蛋白质Western blot鉴定免疫共沉淀产物8
2.3 MGG_01873、MGG_02525与MoRgs7的互作关系验证10
3讨论11
致谢12
参考文献13
附表114
稻瘟病菌MoRgs7互作蛋白的筛选
引言
稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界水稻生产上最严重的真菌病害之一[1]。据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约占总产量的10％～30％，经济损失达数十亿美元[2]。生产上人们广泛地采用选育抗病品种及利用化学农药防治该病害，但是该病菌容易产生致病性变异，产生新的致病种群及抗药种群，从而导致新选育的抗病品种丧失利用价值及化学农药失去防治作用，造成严重的农业损失[3]。稻瘟病菌的致病过程是稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用的过程。稻瘟病菌以一种真菌典型的方式侵染水稻：分生孢子在外力作用下接触水稻叶片，萌发出芽管，随后在芽管尖端分化成一个独特的侵染结构－附着胞。附着胞内因积累甘油等物质从而可以产生巨大的膨压，在压力作用下侵入钉通过穿透叶片表皮并产生侵入菌丝，从而进一步侵染水稻细胞。之后病斑处会产生大量的分生孢子，从而引起新的侵染过程。
稻瘟病菌在侵染过程中需要识别寄主信号，并将信号传递到细胞内。G蛋白（Guaninenucleotidebinding protein）是指能与鸟苷酸结合，具有GTP酶水解活性，广泛存在于真核生物细胞中的一类蛋白。G蛋白是一个超级家族蛋白，包括膜受体偶联的异三聚体G蛋白。异三聚体G蛋白的分子量大，是受鸟苷酸调控的超级家族的信号传导分子，它由α亚基（Gα）、β亚基（Gβ）、γ亚基（Gγ）组成，三个亚基聚合形成异三聚体，其中α分子量最大，是异三聚体鸟苷酸的结合位点。G蛋白介导的细胞信号转导是真核生物细胞信号转导机制中最为保守的信号转导途径之一，它将胞外信号转换为胞内信号，并传递给下游的效应分子（effectors），进而调节细胞的生长发育等过程。
异三聚体G蛋白作为一个分子开关在G蛋白偶联受体GPCR介导的信号途径中具有重要作用。G蛋白介导的信号通路是将外源信号整合到胞内的重要调节机制之一[4]。在真菌中，异三聚体G蛋白调控腺苷酸环化酶及磷脂酶活性，参与营养生长、产孢、致病力及侵染结构的分化等生理过程[5][6]。在没有外界信号刺激的情况下，G蛋白Gα亚基与GDP结合，Gα与Gβ及Gγ亚基以一个异三聚体的复合物存在，此时的G蛋白处于非活性状态。当感受外界信号后，GPCR作为鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor：GEF)和信号分子结合引起构象改变，形成激活型受体，并与G蛋白的Gα亚基结合，引起Gα亚基构象改变，释放GDP，结合GTP，形成激活态的Gα亚基，同时Gβγ异二聚体解离，并分别与下游的效应分子结合，将信号传递下去。G蛋白下游的效应分子有多种，包括腺苷酸环化酶、磷脂酶、蛋白激酶Ste20等。将信号传递给下游效应分子后，Gα亚基自身具有的GTP酶水解活性将GTP水解为GDP，使Gα与GDP结合，与Gβγ亚基复合体重新聚合为失活的异三聚体状态，最终关闭GPCR信号，完成一次信号跨膜转换。在稻瘟病菌中鉴定到3个Gα亚基（MagA、MagB和 MagC）、一个Gβ亚基（Mgb1）以及一个Gγ亚基(MGG_10193)。在有些生物中，GαGDP可与另一GEF蛋白Ric8相互作用，从而重新激活Gα活性[7][8]。
G蛋白信号调控因子的促进Gα亚基对GTP的水解，使G蛋白失活，从而快速关闭G蛋白信号转导途径。而G蛋白调控因子RGS(regulator of G protein signaling)RGS蛋白作为该信号途径的负调控因子，加速GTP的水解速率。本实验室前期研究中已鉴定到稻瘟病菌中8个RGS编码蛋白MoRgs18，8个Rgs蛋白都含有保守的RGS功能域。对这8个蛋白进行生物学分析后发现，RGS蛋白参与稻瘟病菌的多个生理生化过程，包括营养生长、产孢、附着胞形成与分化、菌丝的侵入与扩展，胞内cAMP浓度等 [9]。在8个RGS蛋白中MoRgs7的结构非常特殊，在其N端具有一个信号肽和7次跨膜结构，在C末端具有一个RGS功能域。通过对MoRGS7缺失突变体菌株的表型分析，发现MoRGS7影响稻瘟病菌的致病力[10] 。为进一步阐明MoRGS7在稻瘟病菌致病过程中的分子作用机制，本文采用CoIP方法筛选与其互作的蛋白，根据KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）将这些蛋白功能进行分类，发现这些蛋白参与细胞生命活动的多个方面，并对其中的MGG_01873、MGG_02525与MoRgs7的互作关系进行了一对一验证分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1基本材料3
1.1.1供试菌株与培养条件 3
1.1.2质粒载体 3
1.1.3主要抗生素和试剂 3
1.2常用培养基和溶液的配制 3
1.3实验方法 3
1.3.1coIP筛选互作蛋白3
1.3.1.1表达载体构建及原生质体转化 3
1.3.1.2表达菌株筛选及coIP4
1.3.1.3蛋白质谱测序 5
1.3.2稻瘟病菌总RNA的提取 5
1.3.3合成模板cDNA 5
1.3.4酵母双杂载体构建 5
1.3.4.1 PCR扩增 6
1.3.4.2 PCR产物回收 6
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MoRgs7质粒7
1.3.4.5感受态细胞制备及转化 7
1.3.4.6菌落PCR筛选阳性克隆 7
1.3.4.7质粒提取 7
1.3.4.8测序 8
1.3.5酵母双杂验证 8
2结果与分析 8
2.1D7TM MoRGS7 STag表达菌株的获得8
2.2免疫共沉淀分离与MoRgs7相互作用的蛋白质Western blot鉴定免疫共沉淀产物8
2.3 MGG_01873、MGG_02525与MoRgs7的互作关系验证10
3讨论11
致谢12
参考文献13
附表114
稻瘟病菌MoRgs7互作蛋白的筛选
引言
稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界水稻生产上最严重的真菌病害之一[1]。据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约占总产量的10％～30％，经济损失达数十亿美元[2]。生产上人们广泛地采用选育抗病品种及利用化学农药防治该病害，但是该病菌容易产生致病性变异，产生新的致病种群及抗药种群，从而导致新选育的抗病品种丧失利用价值及化学农药失去防治作用，造成严重的农业损失[3]。稻瘟病菌的致病过程是稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用的过程。稻瘟病菌以一种真菌典型的方式侵染水稻：分生孢子在外力作用下接触水稻叶片，萌发出芽管，随后在芽管尖端分化成一个独特的侵染结构－附着胞。附着胞内因积累甘油等物质从而可以产生巨大的膨压，在压力作用下侵入钉通过穿透叶片表皮并产生侵入菌丝，从而进一步侵染水稻细胞。之后病斑处会产生大量的分生孢子，从而引起新的侵染过程。
稻瘟病菌在侵染过程中需要识别寄主信号，并将信号传递到细胞内。G蛋白（Guaninenucleotidebinding protein）是指能与鸟苷酸结合，具有GTP酶水解活性，广泛存在于真核生物细胞中的一类蛋白。G蛋白是一个超级家族蛋白，包括膜受体偶联的异三聚体G蛋白。异三聚体G蛋白的分子量大，是受鸟苷酸调控的超级家族的信号传导分子，它由α亚基（Gα）、β亚基（Gβ）、γ亚基（Gγ）组成，三个亚基聚合形成异三聚体，其中α分子量最大，是异三聚体鸟苷酸的结合位点。G蛋白介导的细胞信号转导是真核生物细胞信号转导机制中最为保守的信号转导途径之一，它将胞外信号转换为胞内信号，并传递给下游的效应分子（effectors），进而调节细胞的生长发育等过程。
异三聚体G蛋白作为一个分子开关在G蛋白偶联受体GPCR介导的信号途径中具有重要作用。G蛋白介导的信号通路是将外源信号整合到胞内的重要调节机制之一[4]。在真菌中，异三聚体G蛋白调控腺苷酸环化酶及磷脂酶活性，参与营养生长、产孢、致病力及侵染结构的分化等生理过程[5][6]。在没有外界信号刺激的情况下，G蛋白Gα亚基与GDP结合，Gα与Gβ及Gγ亚基以一个异三聚体的复合物存在，此时的G蛋白处于非活性状态。当感受外界信号后，GPCR作为鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor：GEF)和信号分子结合引起构象改变，形成激活型受体，并与G蛋白的Gα亚基结合，引起Gα亚基构象改变，释放GDP，结合GTP，形成激活态的Gα亚基，同时Gβγ异二聚体解离，并分别与下游的效应分子结合，将信号传递下去。G蛋白下游的效应分子有多种，包括腺苷酸环化酶、磷脂酶、蛋白激酶Ste20等。将信号传递给下游效应分子后，Gα亚基自身具有的GTP酶水解活性将GTP水解为GDP，使Gα与GDP结合，与Gβγ亚基复合体重新聚合为失活的异三聚体状态，最终关闭GPCR信号，完成一次信号跨膜转换。在稻瘟病菌中鉴定到3个Gα亚基（MagA、MagB和 MagC）、一个Gβ亚基（Mgb1）以及一个Gγ亚基(MGG_10193)。在有些生物中，GαGDP可与另一GEF蛋白Ric8相互作用，从而重新激活Gα活性[7][8]。
G蛋白信号调控因子的促进Gα亚基对GTP的水解，使G蛋白失活，从而快速关闭G蛋白信号转导途径。而G蛋白调控因子RGS(regulator of G protein signaling)RGS蛋白作为该信号途径的负调控因子，加速GTP的水解速率。本实验室前期研究中已鉴定到稻瘟病菌中8个RGS编码蛋白MoRgs18，8个Rgs蛋白都含有保守的RGS功能域。对这8个蛋白进行生物学分析后发现，RGS蛋白参与稻瘟病菌的多个生理生化过程，包括营养生长、产孢、附着胞形成与分化、菌丝的侵入与扩展，胞内cAMP浓度等 [9]。在8个RGS蛋白中MoRgs7的结构非常特殊，在其N端具有一个信号肽和7次跨膜结构，在C末端具有一个RGS功能域。通过对MoRGS7缺失突变体菌株的表型分析，发现MoRGS7影响稻瘟病菌的致病力[10] 。为进一步阐明MoRGS7在稻瘟病菌致病过程中的分子作用机制，本文采用CoIP方法筛选与其互作的蛋白，根据KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）将这些蛋白功能进行分类，发现这些蛋白参与细胞生命活动的多个方面，并对其中的MGG_01873、MGG_02525与MoRgs7的互作关系进行了一对一验证分析。
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