蛋白电泳在水稻种子真实性与纯度鉴定上的应用
以4个品种的种子为试验材料，采用SDS-PAGE电泳方法获得水稻种子贮藏蛋白的电泳图谱，比较分析其多态性；同时研究种子蛋白SDS-PAGE技术鉴定水稻品种真实性和纯度的可行性。结果表明总蛋白的SDS-PAGE 谱带在4个水稻品种间均存在差异,且每两各品种间都有数条特征带，有较强的多态性。利用这种多态性可以将真假种子区分开来，并测算出种子纯度分别为品种新两优6380的纯度为98%，品种Ⅱ优728的纯度为98%，品种盐两优888的纯度为97%，品种深两优9310的纯度为100%。发现利用蛋白电泳对水稻种子的真实性与纯度鉴定具有灵敏度和可靠性较高、应用范围广、成本低以及不易受环境因素影响、可在较短时间内鉴定比较多的种子等优点, 因而可广泛应用于水稻品种的真实性和纯度鉴定。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 真实性与纯度鉴定 2
1.3 SDSPAGE2
1.3.1 蛋白的提取及电泳样品的准备2
1.3.2 SDSPAGE电泳3
1.4 数据分析3
2 结果与分析3
2.1 水稻种子总蛋白SDSPAGE电泳图谱分析3
2.2 水稻种子真实性鉴定 4
2.3 各品种水稻种子纯度鉴定4
3 讨论6
3．1 蛋白质电泳的多态性6
3．2 蛋白质电泳在真实性与纯度鉴定上的可行性7
致谢7
参考文献7
图1 各品种水稻种子电泳图像4
图2 新两优6380的真种子和假种子4
图3 品种盐两优888的水稻种子SDSPAGE电泳图（部分）5
图4 品种深两优9310的水稻种子SDSPAGE电泳图（部分）6
表1 SDSPAGE相关试剂配方表2
表2 各品种水稻种子电泳Rf 值分析表4
表3 品种盐两优888水稻种子电泳分析表（部分）5
表4 品种深两优9310水稻
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
种子电泳分析表（部分）6
蛋白电泳在水稻种子真实性与纯度鉴定上的应用
引言
我国是一个水稻生产大国，长久以来科学家们一直致力于培育高产高质的水稻品种。但近年来，一些不法商人，利用假冒伪劣的种子出售，获取暴利，导致一些农户发生巨大经济损失，也给粮食安全带来了威胁。此外,为使育种者的知识产权得以保护,也迫切需要对新品种、新品系、新种质进行鉴定。因此,研究可靠实用的种子的真实性和种子纯度鉴定方法是一项亟待解决的重大课题［1］。
对水稻品种真实性和纯度鉴定有种子形态鉴定法[2] 、化学鉴定法[3] 、幼苗鉴定法[ 4] 和田间小区种植鉴定[5,6]等, 但这些方法存在准确性较差、应用范围窄和所需时间长、成本高以及易受环境因素影响等缺点。同工酶多态性分析也曾用于水稻品种的鉴定[7] , 但在遗传关系比较近似的品种间难于找到较大的多态性, 而且该法也存在结果不稳定的缺陷。
分析作物贮藏蛋白质电泳技术是目前种子纯度检验中广泛适用的方法,其中蛋白质十二烷基磺酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳即一已被认为是一种简便、快速、可靠和成本较低的品种真实性和纯度鉴定方法。利用SDSPAGE蛋白质电泳方法鉴定作物真实性和纯度，已在辣椒[8]、啤酒大麦[9]、菜豆[10]中获得成功，水稻种子贮藏蛋白质提取容易,无需低温,需时较短,再加上不同品种因遗传组成不同,其种子贮藏蛋白质在种类、数量、大小及结构等方面也不同,可通过电泳形成不同的蛋白质谱带,从而鉴别品种的真实性和纯度。水稻杂交种与其亲本种子、包括部分外观形态与杂交种相似的常规种子的SDS— PAGE蛋白电泳图上各具有自己的特征性谱带,其谱带数目、位置、宽窄和颜色深浅都存在明显的差异。利用这种差异,在同一实验条件下用SDSPAGE蛋白电泳结果鉴别杂交水稻种子是可行的[11]。
1 材料与方法
1.1材料
新两优6380，Ⅱ优728，盐两优888，深两优9310。分子量为220kD的Maker
1.2真实性与纯度鉴定
各品种随机取100粒单粒种子进行真实性和纯度鉴定
1.3 SDSPAGE
试剂名称
Name of reagent
配制方法
Prescription of reagent
30%单体贮备液
30 g丙烯酰胺，0.8 g N，N(甲叉丙烯酰胺，溶解后加水 定容至100 mL，过滤，4℃保存
4×分离胶缓冲液
18.17 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCI调整pH至8.8，定容至100 mL
4℃保存
4×浓缩胶缓冲液
6.06 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCl调整pH至6.8，定容至100 mL
4℃保存
10%过硫酸铵
0.1 g过硫酸铵，1 mL水，现配现用
10%TEMED
0.1 mL TEMED，0.9 mL水，4℃保存
蛋白提取液
50 Mm TrisHCl，0.01 M 2巯基乙醇，pH 8.0，4℃保存
4×样品缓冲液
0.6g Tris，1 SDS，12.5 mL甘油，加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.0，再加0.05 g溴酚蓝,2.5 mL (巯基乙醇，定容至50mL，分装至20℃保存
电极缓冲液
3.03 g Tris，1.0g SDS，14.4g甘氨酸，加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.3，定容至1000 mL
固定液
40%甲醇，10%乙酸，50%水
G250染色液
0.4 g考马斯亮蓝G250，40 g硫酸铵，8 mL磷酸，100 mL甲醇，定容至500 mL
R250染色液
125 mL甲醇，50 mL乙酸，0.5 g考马斯亮蓝R250，溶解一夜后定容至500 mL
快速脱色液
100 mL乙酸，300 mL甲醇，600 mL水混匀
慢速脱色液
100 mL乙酸，100 mL甲醇，800 mL水混匀
12.5% SDSPAGE分离胶
15 mL分离胶缓冲液，25mL ArcBis，19 mL蒸馏水，1 mL 10%过硫酸铵，20 uL TEMED
5% DSDPAGE浓缩胶
1.5 mL浓缩胶缓冲液，2.5 mL ArcBis，5 mL蒸馏水，0.5 mL10%过硫酸铵，20 uL TEMED
1.3.1蛋白的提取及电泳样品的准备
将每粒水稻种子充分研磨成粉末，置于1.5 mL离心管中，加1mL蛋白提取液放于37℃摇床提取1h；
4 ℃，12000 rpm离心15 min，取上清；
取100μL相同浓度的样品按4:1比例加入样品缓冲液；
样品充分涡旋混匀并煮沸3～5 min待用。
1.3.2 SDSPAGE电泳
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 真实性与纯度鉴定 2
1.3 SDSPAGE2
1.3.1 蛋白的提取及电泳样品的准备2
1.3.2 SDSPAGE电泳3
1.4 数据分析3
2 结果与分析3
2.1 水稻种子总蛋白SDSPAGE电泳图谱分析3
2.2 水稻种子真实性鉴定 4
2.3 各品种水稻种子纯度鉴定4
3 讨论6
3．1 蛋白质电泳的多态性6
3．2 蛋白质电泳在真实性与纯度鉴定上的可行性7
致谢7
参考文献7
图1 各品种水稻种子电泳图像4
图2 新两优6380的真种子和假种子4
图3 品种盐两优888的水稻种子SDSPAGE电泳图（部分）5
图4 品种深两优9310的水稻种子SDSPAGE电泳图（部分）6
表1 SDSPAGE相关试剂配方表2
表2 各品种水稻种子电泳Rf 值分析表4
表3 品种盐两优888水稻种子电泳分析表（部分）5
表4 品种深两优9310水稻
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
种子电泳分析表（部分）6
蛋白电泳在水稻种子真实性与纯度鉴定上的应用
引言
我国是一个水稻生产大国，长久以来科学家们一直致力于培育高产高质的水稻品种。但近年来，一些不法商人，利用假冒伪劣的种子出售，获取暴利，导致一些农户发生巨大经济损失，也给粮食安全带来了威胁。此外,为使育种者的知识产权得以保护,也迫切需要对新品种、新品系、新种质进行鉴定。因此,研究可靠实用的种子的真实性和种子纯度鉴定方法是一项亟待解决的重大课题［1］。
对水稻品种真实性和纯度鉴定有种子形态鉴定法[2] 、化学鉴定法[3] 、幼苗鉴定法[ 4] 和田间小区种植鉴定[5,6]等, 但这些方法存在准确性较差、应用范围窄和所需时间长、成本高以及易受环境因素影响等缺点。同工酶多态性分析也曾用于水稻品种的鉴定[7] , 但在遗传关系比较近似的品种间难于找到较大的多态性, 而且该法也存在结果不稳定的缺陷。
分析作物贮藏蛋白质电泳技术是目前种子纯度检验中广泛适用的方法,其中蛋白质十二烷基磺酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳即一已被认为是一种简便、快速、可靠和成本较低的品种真实性和纯度鉴定方法。利用SDSPAGE蛋白质电泳方法鉴定作物真实性和纯度，已在辣椒[8]、啤酒大麦[9]、菜豆[10]中获得成功，水稻种子贮藏蛋白质提取容易,无需低温,需时较短,再加上不同品种因遗传组成不同,其种子贮藏蛋白质在种类、数量、大小及结构等方面也不同,可通过电泳形成不同的蛋白质谱带,从而鉴别品种的真实性和纯度。水稻杂交种与其亲本种子、包括部分外观形态与杂交种相似的常规种子的SDS— PAGE蛋白电泳图上各具有自己的特征性谱带,其谱带数目、位置、宽窄和颜色深浅都存在明显的差异。利用这种差异,在同一实验条件下用SDSPAGE蛋白电泳结果鉴别杂交水稻种子是可行的[11]。
1 材料与方法
1.1材料
新两优6380，Ⅱ优728，盐两优888，深两优9310。分子量为220kD的Maker
1.2真实性与纯度鉴定
各品种随机取100粒单粒种子进行真实性和纯度鉴定
1.3 SDSPAGE
试剂名称
Name of reagent
配制方法
Prescription of reagent
30%单体贮备液
30 g丙烯酰胺，0.8 g N，N(甲叉丙烯酰胺，溶解后加水 定容至100 mL，过滤，4℃保存
4×分离胶缓冲液
18.17 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCI调整pH至8.8，定容至100 mL
4℃保存
4×浓缩胶缓冲液
6.06 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCl调整pH至6.8，定容至100 mL
4℃保存
10%过硫酸铵
0.1 g过硫酸铵，1 mL水，现配现用
10%TEMED
0.1 mL TEMED，0.9 mL水，4℃保存
蛋白提取液
50 Mm TrisHCl，0.01 M 2巯基乙醇，pH 8.0，4℃保存
4×样品缓冲液
0.6g Tris，1 SDS，12.5 mL甘油，加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.0，再加0.05 g溴酚蓝,2.5 mL (巯基乙醇，定容至50mL，分装至20℃保存
电极缓冲液
3.03 g Tris，1.0g SDS，14.4g甘氨酸，加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.3，定容至1000 mL
固定液
40%甲醇，10%乙酸，50%水
G250染色液
0.4 g考马斯亮蓝G250，40 g硫酸铵，8 mL磷酸，100 mL甲醇，定容至500 mL
R250染色液
125 mL甲醇，50 mL乙酸，0.5 g考马斯亮蓝R250，溶解一夜后定容至500 mL
快速脱色液
100 mL乙酸，300 mL甲醇，600 mL水混匀
慢速脱色液
100 mL乙酸，100 mL甲醇，800 mL水混匀
12.5% SDSPAGE分离胶
15 mL分离胶缓冲液，25mL ArcBis，19 mL蒸馏水，1 mL 10%过硫酸铵，20 uL TEMED
5% DSDPAGE浓缩胶
1.5 mL浓缩胶缓冲液，2.5 mL ArcBis，5 mL蒸馏水，0.5 mL10%过硫酸铵，20 uL TEMED
1.3.1蛋白的提取及电泳样品的准备
将每粒水稻种子充分研磨成粉末，置于1.5 mL离心管中，加1mL蛋白提取液放于37℃摇床提取1h；
4 ℃，12000 rpm离心15 min，取上清；
取100μL相同浓度的样品按4:1比例加入样品缓冲液；
样品充分涡旋混匀并煮沸3～5 min待用。
1.3.2 SDSPAGE电泳
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/528.html
