棉铃虫cry1ac抗性相关hacad突变基因r1的真核表达
摘要：棉铃虫幼虫中肠细胞微绒毛上的钙粘蛋白（HaCad）是Bt毒素Cry1Ac的重要受体，该蛋白的重复子10和重复子11是目前预测的Bt毒素结合区。HaCad突变基因r1是在胞外区第3个重复子产生了一个提前终止密码子的突变，可导致整个Bt毒素结合区的缺失。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞系中表达出HaCad突变基因r1的蛋白，并在体外对其与Cry1Ac毒力之间的关系进行了系统性研究。免疫荧光定位分析显示r1基因编码的蛋白都能够在Sf9细胞膜上表达，但不能与Cry1Ac结合。细胞毒力测定结果显示，与160nM Cry1Ac毒素孵育后，感染野生型钙粘蛋白HaCad重组病毒的Sf9细胞死亡率达到86.2±0.8%，而感染r1重组病毒的Sf9细胞死亡率达到3.1±0.8%，二者之间存在显著性差异。感染pFastBac1空载体Bacmid的Sf9细胞死亡率较低，仅为3.4±0.7%，与感染r1重组病毒的Sf9细胞死亡率之间无显著性差异。该结果表明，棉铃虫钙粘蛋白突变基因r1突变能够使Cry1Ac毒力显著降低。本文研究结果对于明确Cry1Ac毒素毒杀棉铃虫的分子机理、进而预测棉铃虫潜在的抗性机理具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 2种钙粘蛋白表达载体的构建 2
1.2 重组Bacmid的获得2
1.2.1 转座反应2
1.2.2 重组Bacmid的提取和Bacmid DNA的PCR鉴定3
1.3 重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染3
1.3.1 昆虫细胞的培养3
1.3.2 制备P1病毒液3
1.3.3 制备P2病毒液3
1.3.4 P3病毒液的制备与鉴定3
1.4 免疫荧光定位分析4
1.5 细胞毒力测定5
1.6 数据分析5
2 结果与分析5
2.1 钙粘蛋白突变基因r1在Sf9细胞中的表达5
2.2 免疫荧光定位分析6
2.3 Cry
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
1Ac结合分析6
2.4 Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒力分析7
3 讨论 8
致谢8
参考文献8
棉铃虫Cry1Ac抗性相关HaCad突变基因
r1的真核表达
引言
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的伴孢晶体蛋白具有杀虫活力，被广泛应用于害虫的防治，对于棉铃虫Helicoverpa armigera ( Hübner )也有很好的防治效果。我国自1997年开始推广种植表达Cry1Ac毒素蛋白的Bt棉花，2013年Bt棉花种植面积达到420万公顷[1]。Bt棉花的规模化种植不仅有效控制了棉铃虫对主要寄主作物棉花的危害，也抑制了棉铃虫在其它寄主作物上的发生与危害，同时也减少了防治棉铃虫的化学杀虫剂用量。Bt棉花的推广种植提升了农业生态系统的生物防治功能，带来了明显的经济、环境和社会效益[2，3]。但随着Bt棉花种植面积的不断增加，主要靶标害虫棉铃虫承受着空前的毒素选择压力，这势必会引起棉铃虫的抗性演化，严重影响Bt棉的使用寿命。
钙粘蛋白是一类位于细胞膜上的Ca2+离子结合蛋白，在细胞粘连、迁移、细胞骨架组织和形态发生方面具有重要作用。钙粘蛋白也是一类跨膜蛋白，其分子结构由一个或多个重复子（cadherin repeats，CRs）、一个跨膜区和一个较小的胞内区组成。昆虫钙粘蛋白重复子区域是预测的Bt毒素结合区。已经报道烟草天蛾Manduca sexta和家蚕Bombyx mori Linnaeus的钙粘蛋白存在至少三个毒素结合区，在棉铃虫和棉红铃虫Pectinophora gossypiella（Saunders）的钙粘蛋白受体上存在多个结合区域，这些毒素结合区比较保守，位于钙粘蛋白的重复子区和近膜区[47]。
随着我国Bt使用量和转Bt基因作物的迅速增长，转入的Cry基因在作物体内持续表达，使害虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择，因而害虫对Bt的抗药性已经成为一个不容忽视的问题。在鳞翅目昆虫中，已有一系列研究证明钙粘蛋白是Cry1A类毒素的受体且钙粘蛋白基因的突变可以引起其对Cry1A类毒素的抗性[811]。钙粘蛋白突变基因r1是位于钙粘蛋白胞外区的DNA缺失突变，第8个外显子和第25个外显子之间缺失了8.8kb。这个缺失产生了提前终止密码子，造成部分胞外区和整个跨膜区、胞内区的缺失，翻译后仅含有428个氨基酸残基。研究表明此类Cadherin类受体的缺失与棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性紧密连锁[12，13]。
本研究拟利用昆虫杆状病毒表达系统（BactoBac Baculovirus Expression System)在Sf9细胞系中表达出HaCad突变基因r1的蛋白，并在体外系统性地对其与Cry1Ac毒力之间的关系进行研究。研究结果对于明确Cry1Ac毒杀棉铃虫的分子机理、进而预测棉铃虫潜在的抗性机理具有重要意义，还有利于了解田间棉铃虫的抗性基因的发展状况，为田间棉铃虫的抗性监测提供技术支持，为以后Bt棉上棉铃虫的防控措施的制定提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 2种钙粘蛋白表达载体的构建
本试验构建了2种钙粘蛋白基因的表达载体：敏感品系SCD钙粘蛋白基因s，抗性品系SCDr1的钙粘蛋白基因r1。利用SV总RNA提取试剂盒提取敏感品系SCD和抗性品系SCDr1单头幼虫中肠总RNA，并合成cDNA。分别以这两个cDNA为模板，利用上下游引物HaCadEcoRⅠF和HaCadXbaⅠR进行PCR扩增，获得两个品系的钙粘蛋白基因开发阅读框序列全长，EcoRⅠ和XbaⅠ是酶切位点。
构建载体过程中的PCR反应均采用PrimeSTAR? HS高保真DNA聚合酶（TakaR，大连），利用Wizard? DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。用EcoRⅠ和XbaⅠ对门户载体pFastBac1（Invitrogrn，上海）和纯化的2种钙粘蛋白基因PCR产物进行双酶切，酶切反应体系见Fermentas公司说明书。参照Wizard? DNA纯化试剂盒说明书回收酶切产物。用T4 DNA连接酶（Promega）对经酶切回收后的目的基因和对应的双酶切pFastBac1载体进行连接，连接体系及条件见说明书。
10×T4 ligase buffer 1μl
酶切回收的目的基因 3μl
酶切回收的pFastBac1 1μl
T4 DNA ligase 1μl
ddH20 4μl
Total 10μl
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 2种钙粘蛋白表达载体的构建 2
1.2 重组Bacmid的获得2
1.2.1 转座反应2
1.2.2 重组Bacmid的提取和Bacmid DNA的PCR鉴定3
1.3 重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染3
1.3.1 昆虫细胞的培养3
1.3.2 制备P1病毒液3
1.3.3 制备P2病毒液3
1.3.4 P3病毒液的制备与鉴定3
1.4 免疫荧光定位分析4
1.5 细胞毒力测定5
1.6 数据分析5
2 结果与分析5
2.1 钙粘蛋白突变基因r1在Sf9细胞中的表达5
2.2 免疫荧光定位分析6
2.3 Cry
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
1Ac结合分析6
2.4 Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒力分析7
3 讨论 8
致谢8
参考文献8
棉铃虫Cry1Ac抗性相关HaCad突变基因
r1的真核表达
引言
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的伴孢晶体蛋白具有杀虫活力，被广泛应用于害虫的防治，对于棉铃虫Helicoverpa armigera ( Hübner )也有很好的防治效果。我国自1997年开始推广种植表达Cry1Ac毒素蛋白的Bt棉花，2013年Bt棉花种植面积达到420万公顷[1]。Bt棉花的规模化种植不仅有效控制了棉铃虫对主要寄主作物棉花的危害，也抑制了棉铃虫在其它寄主作物上的发生与危害，同时也减少了防治棉铃虫的化学杀虫剂用量。Bt棉花的推广种植提升了农业生态系统的生物防治功能，带来了明显的经济、环境和社会效益[2，3]。但随着Bt棉花种植面积的不断增加，主要靶标害虫棉铃虫承受着空前的毒素选择压力，这势必会引起棉铃虫的抗性演化，严重影响Bt棉的使用寿命。
钙粘蛋白是一类位于细胞膜上的Ca2+离子结合蛋白，在细胞粘连、迁移、细胞骨架组织和形态发生方面具有重要作用。钙粘蛋白也是一类跨膜蛋白，其分子结构由一个或多个重复子（cadherin repeats，CRs）、一个跨膜区和一个较小的胞内区组成。昆虫钙粘蛋白重复子区域是预测的Bt毒素结合区。已经报道烟草天蛾Manduca sexta和家蚕Bombyx mori Linnaeus的钙粘蛋白存在至少三个毒素结合区，在棉铃虫和棉红铃虫Pectinophora gossypiella（Saunders）的钙粘蛋白受体上存在多个结合区域，这些毒素结合区比较保守，位于钙粘蛋白的重复子区和近膜区[47]。
随着我国Bt使用量和转Bt基因作物的迅速增长，转入的Cry基因在作物体内持续表达，使害虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择，因而害虫对Bt的抗药性已经成为一个不容忽视的问题。在鳞翅目昆虫中，已有一系列研究证明钙粘蛋白是Cry1A类毒素的受体且钙粘蛋白基因的突变可以引起其对Cry1A类毒素的抗性[811]。钙粘蛋白突变基因r1是位于钙粘蛋白胞外区的DNA缺失突变，第8个外显子和第25个外显子之间缺失了8.8kb。这个缺失产生了提前终止密码子，造成部分胞外区和整个跨膜区、胞内区的缺失，翻译后仅含有428个氨基酸残基。研究表明此类Cadherin类受体的缺失与棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性紧密连锁[12，13]。
本研究拟利用昆虫杆状病毒表达系统（BactoBac Baculovirus Expression System)在Sf9细胞系中表达出HaCad突变基因r1的蛋白，并在体外系统性地对其与Cry1Ac毒力之间的关系进行研究。研究结果对于明确Cry1Ac毒杀棉铃虫的分子机理、进而预测棉铃虫潜在的抗性机理具有重要意义，还有利于了解田间棉铃虫的抗性基因的发展状况，为田间棉铃虫的抗性监测提供技术支持，为以后Bt棉上棉铃虫的防控措施的制定提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 2种钙粘蛋白表达载体的构建
本试验构建了2种钙粘蛋白基因的表达载体：敏感品系SCD钙粘蛋白基因s，抗性品系SCDr1的钙粘蛋白基因r1。利用SV总RNA提取试剂盒提取敏感品系SCD和抗性品系SCDr1单头幼虫中肠总RNA，并合成cDNA。分别以这两个cDNA为模板，利用上下游引物HaCadEcoRⅠF和HaCadXbaⅠR进行PCR扩增，获得两个品系的钙粘蛋白基因开发阅读框序列全长，EcoRⅠ和XbaⅠ是酶切位点。
构建载体过程中的PCR反应均采用PrimeSTAR? HS高保真DNA聚合酶（TakaR，大连），利用Wizard? DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。用EcoRⅠ和XbaⅠ对门户载体pFastBac1（Invitrogrn，上海）和纯化的2种钙粘蛋白基因PCR产物进行双酶切，酶切反应体系见Fermentas公司说明书。参照Wizard? DNA纯化试剂盒说明书回收酶切产物。用T4 DNA连接酶（Promega）对经酶切回收后的目的基因和对应的双酶切pFastBac1载体进行连接，连接体系及条件见说明书。
10×T4 ligase buffer 1μl
酶切回收的目的基因 3μl
酶切回收的pFastBac1 1μl
T4 DNA ligase 1μl
ddH20 4μl
Total 10μl
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/736.html
