大豆疫霉根腐病部分抗性关联定位
: 大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的大豆土传性病害，对产量损失严重，是大豆生产上毁灭性病害之一。本研究对163份大豆微核心种质进行部分抗性鉴定，利用138个SSR标记分析群体遗传多样性和群体结构，结合GLM模型对大豆疫霉部分抗性关联分析。关联结果显示，与部分抗性相关的SSR标记一共有4个，即Satt634、Satt135、Sat_222和Satt221，分别分布在连锁群D1b、D2、D1a和D2上，解释率为10%，6%，6%，8%。本研究结果有利于挖掘新的部分抗性位点，为大豆抗病分子辅助选择育种提供理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料和方法2
1.1供试材料 2
1.2供试菌株 3
1.3抗性鉴定方法 3
1.4 DNA提取、标记的选取及SSR标记分型方法 3
1.4.1 DNA提取方法:CTAB法3
1.4.2 SSR标记的选取4
1.4.3 PCR扩增及产物检测4
1.5数据分析5
1.5.1 表型数据分析5
1.5.2 位点多态性分析5
1.5.3 群体结构分析5
1.5.4 关联分析6
2 结果与分析6
2.1 大豆材料完全抗性与部分抗性鉴定6
2.2 SSR标记遗传多样性分析7
2.3群体结构分析10
2.4大豆疫霉根腐病部分抗性关联分析11
3 讨论 11
致谢14
参考文献15
附录17
大豆疫霉根腐病部分抗性关联定位
引言
引言
由大豆疫霉( Phytophthora sojae) 侵染大豆引起的疫霉根腐病( Phytophthora root rot，PRR) 是大豆生产上的毁灭性病害之一[1]。1948 年在美国的印第安那州首次发现该病，迄今在世界大豆主产区呈扩大蔓延趋势[24]。1989 年由沈崇尧等首次在中
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
国东北地区分离到大豆疫霉，随后在其他地区都分离到大豆疫霉，大豆疫霉根腐病的发生范围迅速扩大，危害日趋严重[37]。应用抗、耐病品种是控制大豆疫霉根腐病最经济、有效的方法。大豆疫霉根腐病已在全世界大多数大豆种植区发生。大豆疫病最早报道于美国，目前已在我国多个省份发现，并呈现扩大蔓延趋势。致病病原物为大豆疫霉，是一种土传卵菌，可在大豆整个生长季节侵染大豆各个部位[8]。控制该病最经济、最环保的方法是利用抗性品种。研究发现通过关联分析的方法，定位大豆疫霉根腐病抗性基因，可为抗病育种提供基因。大豆对大豆疫霉的抗性分为两种：（1）由单个抗性基因（Rps基因）介导的小种专化抗性，即完全抗性；（2）由不同效应的多基因控制的部分抗性[9]。一些完全抗性的Rps基因已被广泛应用于商业大豆品种中，它们的使用降低了大豆生产费用和产量损失[10]。然而，由于含有Rps基因的大豆品种的连续使用及大豆疫霉生理小种的变异，使得新的致病生理小种出现，原来具有大豆疫霉抗性的品种丧失了抗性[11]，单个Rps基因有效期一般为8~15年[8]。与Rps基因介导的抗性相比，部分抗性已被证明可以减少寄主组织中的病原物病变的增长率和降低根腐病发生的严重程度，从而限制产量损失[12]。部分抗性更具有持久性，因此，我们应该注重发掘和利用部分抗性。
本研究在对163份大豆微核心种质进行部分抗性鉴定的基础上，利用全基因组的138个SSR标记分析群体遗传多样性和群体结构，并利用GLM模型对大豆疫霉部分抗性相关位点鉴定，为耐大豆疫霉分子辅助育种提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试材料
201份大豆微核心种质经完全抗性鉴定。抗性鉴定方法为下胚轴创伤接种法，将大豆品种、一套含有单个Rps基因鉴别寄主播种于以粗蛭石为基质的塑料杯中，每份播种12粒，播种后置于25°C、14h光照/10h黑暗的温室培养。待第一对真叶平展时，选取10株长势一致的豆苗用于接种。用消毒后的手术刀片在大豆子叶节下约l cm处划一斜口，在培养4~5 d的菌株菌落外缘割取带有菌丝体的培养基（边长为3 mm的方块）嵌入伤口中，接种后保湿48 h，然后转入温室培养，恢复正常条件生长。抗性评价标准：如果一份大豆品种死亡率小于等于30%，则记为抗病（resistant, R）；死亡率在30%~70%的记为中间型（intermediate, I）；在大于等于70%则为感病（susceptible, S），Williams（rps）为感病对照，重复3次鉴定。
发现在接种大豆疫霉菌株P6497（2号生理小种）后，201份大豆种质中163份材料表现为感病，然后将这163份感病材料作为关联群体，进行部分抗性QTL鉴定。
1.2 供试菌株
大豆疫霉2号生理小种（P6497，vir. 1b, 7），由大学植物保护学院提供。供试菌株接种在1%的V8培养基上，在25°C黑暗条件下培养7 d，然后培养物用50 mL的注射器匀浆用于接种。
1.3 抗性鉴定方法
抗性鉴定采用根部创伤接种方法，鉴定指标为病斑长度。具体操作步骤为，将大豆种植于以无菌蛭石为基质的塑料杯中（杯子底部有一小孔，用于浇水）。幼苗在温室（25°C与14h:10h光/暗周期）中生长7 d。将幼苗用水龙头洗去根部蛭石，每个品种选择10株整齐一致的幼苗放入一个铺有湿毛巾托盘中，每个幼苗用手术刀在根茎交界处下2cm切出一个5mm长的伤口用以接种。用大豆疫霉菌丝浆覆盖在伤口上，用湿毛巾将根部覆盖好，20个托盘合并堆放，然后用尼龙绳绑在一起，最后放入装有Hoagland营养液的周转箱中于温室中生长。接种7 d后进行病情调查。测量从接种根部位置到病斑向茎部蔓延终端的长度。实验设计是完全随机，重复3次，Conrad与Williams为对照[1315]。
1.4 DNA提取、标记的选取及SSR标记分型
1.4.1 DNA提取
从每份大豆种质嫩叶中提取基因组DNA。参考CTAB法，详情如下：
DNA提取利用CTAB法（大豆基因组DNA的提取纯化参考Doyle的经典CTAB法在一些具体操作步骤中略有改动）。具体步骤如下：
(1)取2g左右的新鲜叶片放入研钵，加入液氮后迅速研磨直至叶片成粉状。用预冷过的Eppendorf管盛装。
(2)吸取经65℃预热过的CTAB溶液650μl加入装有叶片粉末的Eppendorf管，混匀，放入65℃的水浴锅中水浴60min左右，期间每隔10min左右轻轻摇匀一次。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料和方法2
1.1供试材料 2
1.2供试菌株 3
1.3抗性鉴定方法 3
1.4 DNA提取、标记的选取及SSR标记分型方法 3
1.4.1 DNA提取方法:CTAB法3
1.4.2 SSR标记的选取4
1.4.3 PCR扩增及产物检测4
1.5数据分析5
1.5.1 表型数据分析5
1.5.2 位点多态性分析5
1.5.3 群体结构分析5
1.5.4 关联分析6
2 结果与分析6
2.1 大豆材料完全抗性与部分抗性鉴定6
2.2 SSR标记遗传多样性分析7
2.3群体结构分析10
2.4大豆疫霉根腐病部分抗性关联分析11
3 讨论 11
致谢14
参考文献15
附录17
大豆疫霉根腐病部分抗性关联定位
引言
引言
由大豆疫霉( Phytophthora sojae) 侵染大豆引起的疫霉根腐病( Phytophthora root rot，PRR) 是大豆生产上的毁灭性病害之一[1]。1948 年在美国的印第安那州首次发现该病，迄今在世界大豆主产区呈扩大蔓延趋势[24]。1989 年由沈崇尧等首次在中
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
国东北地区分离到大豆疫霉，随后在其他地区都分离到大豆疫霉，大豆疫霉根腐病的发生范围迅速扩大，危害日趋严重[37]。应用抗、耐病品种是控制大豆疫霉根腐病最经济、有效的方法。大豆疫霉根腐病已在全世界大多数大豆种植区发生。大豆疫病最早报道于美国，目前已在我国多个省份发现，并呈现扩大蔓延趋势。致病病原物为大豆疫霉，是一种土传卵菌，可在大豆整个生长季节侵染大豆各个部位[8]。控制该病最经济、最环保的方法是利用抗性品种。研究发现通过关联分析的方法，定位大豆疫霉根腐病抗性基因，可为抗病育种提供基因。大豆对大豆疫霉的抗性分为两种：（1）由单个抗性基因（Rps基因）介导的小种专化抗性，即完全抗性；（2）由不同效应的多基因控制的部分抗性[9]。一些完全抗性的Rps基因已被广泛应用于商业大豆品种中，它们的使用降低了大豆生产费用和产量损失[10]。然而，由于含有Rps基因的大豆品种的连续使用及大豆疫霉生理小种的变异，使得新的致病生理小种出现，原来具有大豆疫霉抗性的品种丧失了抗性[11]，单个Rps基因有效期一般为8~15年[8]。与Rps基因介导的抗性相比，部分抗性已被证明可以减少寄主组织中的病原物病变的增长率和降低根腐病发生的严重程度，从而限制产量损失[12]。部分抗性更具有持久性，因此，我们应该注重发掘和利用部分抗性。
本研究在对163份大豆微核心种质进行部分抗性鉴定的基础上，利用全基因组的138个SSR标记分析群体遗传多样性和群体结构，并利用GLM模型对大豆疫霉部分抗性相关位点鉴定，为耐大豆疫霉分子辅助育种提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试材料
201份大豆微核心种质经完全抗性鉴定。抗性鉴定方法为下胚轴创伤接种法，将大豆品种、一套含有单个Rps基因鉴别寄主播种于以粗蛭石为基质的塑料杯中，每份播种12粒，播种后置于25°C、14h光照/10h黑暗的温室培养。待第一对真叶平展时，选取10株长势一致的豆苗用于接种。用消毒后的手术刀片在大豆子叶节下约l cm处划一斜口，在培养4~5 d的菌株菌落外缘割取带有菌丝体的培养基（边长为3 mm的方块）嵌入伤口中，接种后保湿48 h，然后转入温室培养，恢复正常条件生长。抗性评价标准：如果一份大豆品种死亡率小于等于30%，则记为抗病（resistant, R）；死亡率在30%~70%的记为中间型（intermediate, I）；在大于等于70%则为感病（susceptible, S），Williams（rps）为感病对照，重复3次鉴定。
发现在接种大豆疫霉菌株P6497（2号生理小种）后，201份大豆种质中163份材料表现为感病，然后将这163份感病材料作为关联群体，进行部分抗性QTL鉴定。
1.2 供试菌株
大豆疫霉2号生理小种（P6497，vir. 1b, 7），由大学植物保护学院提供。供试菌株接种在1%的V8培养基上，在25°C黑暗条件下培养7 d，然后培养物用50 mL的注射器匀浆用于接种。
1.3 抗性鉴定方法
抗性鉴定采用根部创伤接种方法，鉴定指标为病斑长度。具体操作步骤为，将大豆种植于以无菌蛭石为基质的塑料杯中（杯子底部有一小孔，用于浇水）。幼苗在温室（25°C与14h:10h光/暗周期）中生长7 d。将幼苗用水龙头洗去根部蛭石，每个品种选择10株整齐一致的幼苗放入一个铺有湿毛巾托盘中，每个幼苗用手术刀在根茎交界处下2cm切出一个5mm长的伤口用以接种。用大豆疫霉菌丝浆覆盖在伤口上，用湿毛巾将根部覆盖好，20个托盘合并堆放，然后用尼龙绳绑在一起，最后放入装有Hoagland营养液的周转箱中于温室中生长。接种7 d后进行病情调查。测量从接种根部位置到病斑向茎部蔓延终端的长度。实验设计是完全随机，重复3次，Conrad与Williams为对照[1315]。
1.4 DNA提取、标记的选取及SSR标记分型
1.4.1 DNA提取
从每份大豆种质嫩叶中提取基因组DNA。参考CTAB法，详情如下：
DNA提取利用CTAB法（大豆基因组DNA的提取纯化参考Doyle的经典CTAB法在一些具体操作步骤中略有改动）。具体步骤如下：
(1)取2g左右的新鲜叶片放入研钵，加入液氮后迅速研磨直至叶片成粉状。用预冷过的Eppendorf管盛装。
(2)吸取经65℃预热过的CTAB溶液650μl加入装有叶片粉末的Eppendorf管，混匀，放入65℃的水浴锅中水浴60min左右，期间每隔10min左右轻轻摇匀一次。
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