大豆疫霉的生物防治
筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌，可以为寻找病害措施和设计新的疫病控制策略提供基础。从盐城3个不同地区采集大豆根围土壤样本并分离各类土壤微生物，采用对峙培养法筛选出对大豆疫霉有拮抗作用的微生物，并在此基础上对3株拮抗效果较好的细菌菌株AC29、AD29、AD7进行了鉴定，并对其对大豆疫病的控制作用进行了研究，主要研究结果⒈ 经形态观察、生理生化特性测定、16S rDNA序列分析，初步鉴定AC29为枯草芽孢杆菌，AD29和AD7为假单胞菌属。⒉ 对筛选获得的生防菌株进行了盆栽试验测定，结果显示菌株 AC29对大豆疫病的防效显著高于各处理。结论拮抗细菌AC29菌株具有较好的开发成大豆疫病生物防治菌的前景。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
供试培养基3
土壤微生物的分离纯化4
大豆疫霉拮抗菌的筛选4
生防菌代谢液对大豆疫霉的抑菌作用测定4
生防菌AC29胞内物质对大豆疫霉的拮抗作用 4
生防菌活菌液对大豆疫霉孢子的离体防效测定4
生防菌对大豆疫病的盆栽防效试验5
生防菌株的鉴定 5
生防菌株的形态观察 5
革兰氏染色5
生理生化性状测定5
16SrDNA序列分析 6
细菌gDNA的提取 6
16S rDNA 的 PCR 扩增7
结果与分析 8
3.1 大豆疫霉生防菌株的分离筛选 8
3.1.1 拮抗细菌的分离 8
3.1.2 生防菌株对大豆疫霉的平板拮抗作用测定8
3.1.3 生防菌代谢液对大豆疫霉的抑菌作用测定9
3.1.4 生防菌AC29胞内物质对大豆疫霉的拮抗作用 9
3.1.5 生防菌活菌液对大豆疫霉孢子的离体防效测定10
3.1.6 生防菌对大豆疫病的盆栽防效10
3.2 生防菌株的生理生化特性 10
4 讨论11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
4.1 大豆疫病的防治措施 11
4.2 大豆疫霉生防菌株的筛选11
致谢 12
参考文献 12
大豆疫霉拮抗菌株的的筛选、鉴定及拮抗作用
引言
引言
疫霉菌属于卵菌门疫霉属（Phytophthora）菌物，该属中有不少是农作物上的重要病原菌，如大豆疫霉（Phytophthora sojae）、致病疫霉（P. infestans）、辣椒疫霉（P. capsici）等，每年给农作物及林木生产带来严重损失。最著名的例子就是 1845 年爱尔兰发生的马铃薯晚疫病，直接导致百万人饿死，数百万人移民他乡。
大豆是我国重要的农作物，种植面积约 1.5 亿亩，是我国食用油的主要来源，豆油加工的副产品豆粕也是重要的饲料蛋白。我国约有 3700 万人直接以种植大豆为业，还有大量的人群从事食用油加工和以豆粕为饲料的畜牧业。大豆的种植和加工已经发展成我国巨大的农业产业链条。
大豆疫霉（P. sojae）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害
[1]，大豆疫病是典型的土传病害，一旦传入，很难根治。最早于1948年发生在美国，1951年在俄亥俄州及不久在美国中西部的其他州也相继发现此病害，当时认为是由镰刀菌（Fusarium）或间座壳菌（Diaporthe）引致。1955年，该病害病原物在北卡罗纳州发病的大豆幼苗上及俄亥俄州的发病大豆茎部被分离出来，当时认为由恶疫霉（Phytophthora cactorum）引起的。1958年，Kaufmann和Gerdemann对大豆疫霉进行了系统研究后，发现大豆疫霉在形态上与恶疫霉（P. cactorum）存在明显不同，将其作为一个新种正式命名为大豆疫霉（P. sojae）。现已广泛分布亚、非、欧、南北美洲的近二十个国家和地区的大豆主要产区，每年给大豆产带来的直接经济损失高达几十亿美元，成为大豆生产上最严重的病害[23]。在我国，自1991年沈崇尧等[4]首次在东北地区发现该病后，现已经在黑龙江、北京、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、四川、天津等15个省市大豆产区发现此病[58]，说明大豆疫霉在我国的大豆产区有较大范围的发生[9]。
目前，防治大豆疫霉根腐病的方法主要是化学防治，其中使用最多的药剂是甲霜灵（Metalaxy，商品名 Ridomil）。甲霜灵为内吸性杀菌剂，生物活性强，且持效期长[10]。但其对病菌的作用位点单一，病原菌容易对其产生抗性突变，因此，开发新的防治方法在控制大豆疫霉根腐病上尤其重要[11]。为可持续地控制大豆疫病，避免大豆疫病因单一的化学防治而过快地产生抗药性，生物防治已成为大豆疫病防治的重要方法。从大豆疫霉生存的土壤中筛选具有高拮抗活性和易定殖的生物防治菌株，对其进行形态学和分子生物学鉴定，并提取其产生的拮抗物质进行理化特性研究，以期为大豆疫霉根腐病防治提供新的拮抗菌资源，也为开发出新型微生物源农药提供基础。
1 材料与方法
供试培养基
R2A培养基：酵母粉（Yeast Extract）0.5g，氯化钠（Nacl） 0.1g，水解酪蛋白0.25g，葡萄糖（Glucose）0.65g，可溶性淀粉0.5g，酸水解酪素0.5g，磷酸氢二钾（K2HPO4）0.3g，水合硫酸镁（MgSO4?7H2O）0.024g，琼脂（Agar）15g，蒸馏水定容至1L，PH 7.2。WA培养基：蛋白胨5g，葡萄糖（Glucose）10g，牛肉浸膏3g，氯化钠（Nacl）5g，琼脂（Agar）20g，蒸馏水定容至1 L，pH 6.8。PDA培养基：土豆（Potato）200g，葡萄糖（Glucose）10g，琼脂（Agar）16.0g，蒸馏水定容至1L，PH 7.2。PD培养基：土豆（Potato）200g，葡萄糖（Glucose）10g，，蒸馏水定容至1L，PH 7.2。YPG培养基：Yeast Extract 5 g，Peptone 5 g，Glucose 10 g，加入水溶解，最后定容至1L，调pH 7.07.2。蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉6.4 g，溶于240 mL水中，121℃灭菌1 min；B：琼脂（Agar）6.4 g，定容至240 mL。纤维素酶检测培养基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，羧甲基纤维素钠10 g，氯化钠5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂（Agar）18 g，定容至1L，pH7.0。嗜铁素检测培养基：A：60.5mg CAS 溶于50mL去离子水；B：10mL三价铁溶液（1mM FeCl3?6H2O 盐酸为溶剂）；C：72.9mg HDTMA 溶于40mL 去离子水。上述三个溶液混合定容至100mL，pH调至中性。121℃灭菌20 min后，加入900mL的WA培养基中，混合倒平板。明胶琼脂培养基：明胶4g，牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂15g，水1L，ph7.0~7.2。液体培养时不加琼脂。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
供试培养基3
土壤微生物的分离纯化4
大豆疫霉拮抗菌的筛选4
生防菌代谢液对大豆疫霉的抑菌作用测定4
生防菌AC29胞内物质对大豆疫霉的拮抗作用 4
生防菌活菌液对大豆疫霉孢子的离体防效测定4
生防菌对大豆疫病的盆栽防效试验5
生防菌株的鉴定 5
生防菌株的形态观察 5
革兰氏染色5
生理生化性状测定5
16SrDNA序列分析 6
细菌gDNA的提取 6
16S rDNA 的 PCR 扩增7
结果与分析 8
3.1 大豆疫霉生防菌株的分离筛选 8
3.1.1 拮抗细菌的分离 8
3.1.2 生防菌株对大豆疫霉的平板拮抗作用测定8
3.1.3 生防菌代谢液对大豆疫霉的抑菌作用测定9
3.1.4 生防菌AC29胞内物质对大豆疫霉的拮抗作用 9
3.1.5 生防菌活菌液对大豆疫霉孢子的离体防效测定10
3.1.6 生防菌对大豆疫病的盆栽防效10
3.2 生防菌株的生理生化特性 10
4 讨论11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
4.1 大豆疫病的防治措施 11
4.2 大豆疫霉生防菌株的筛选11
致谢 12
参考文献 12
大豆疫霉拮抗菌株的的筛选、鉴定及拮抗作用
引言
引言
疫霉菌属于卵菌门疫霉属（Phytophthora）菌物，该属中有不少是农作物上的重要病原菌，如大豆疫霉（Phytophthora sojae）、致病疫霉（P. infestans）、辣椒疫霉（P. capsici）等，每年给农作物及林木生产带来严重损失。最著名的例子就是 1845 年爱尔兰发生的马铃薯晚疫病，直接导致百万人饿死，数百万人移民他乡。
大豆是我国重要的农作物，种植面积约 1.5 亿亩，是我国食用油的主要来源，豆油加工的副产品豆粕也是重要的饲料蛋白。我国约有 3700 万人直接以种植大豆为业，还有大量的人群从事食用油加工和以豆粕为饲料的畜牧业。大豆的种植和加工已经发展成我国巨大的农业产业链条。
大豆疫霉（P. sojae）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害
[1]，大豆疫病是典型的土传病害，一旦传入，很难根治。最早于1948年发生在美国，1951年在俄亥俄州及不久在美国中西部的其他州也相继发现此病害，当时认为是由镰刀菌（Fusarium）或间座壳菌（Diaporthe）引致。1955年，该病害病原物在北卡罗纳州发病的大豆幼苗上及俄亥俄州的发病大豆茎部被分离出来，当时认为由恶疫霉（Phytophthora cactorum）引起的。1958年，Kaufmann和Gerdemann对大豆疫霉进行了系统研究后，发现大豆疫霉在形态上与恶疫霉（P. cactorum）存在明显不同，将其作为一个新种正式命名为大豆疫霉（P. sojae）。现已广泛分布亚、非、欧、南北美洲的近二十个国家和地区的大豆主要产区，每年给大豆产带来的直接经济损失高达几十亿美元，成为大豆生产上最严重的病害[23]。在我国，自1991年沈崇尧等[4]首次在东北地区发现该病后，现已经在黑龙江、北京、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、四川、天津等15个省市大豆产区发现此病[58]，说明大豆疫霉在我国的大豆产区有较大范围的发生[9]。
目前，防治大豆疫霉根腐病的方法主要是化学防治，其中使用最多的药剂是甲霜灵（Metalaxy，商品名 Ridomil）。甲霜灵为内吸性杀菌剂，生物活性强，且持效期长[10]。但其对病菌的作用位点单一，病原菌容易对其产生抗性突变，因此，开发新的防治方法在控制大豆疫霉根腐病上尤其重要[11]。为可持续地控制大豆疫病，避免大豆疫病因单一的化学防治而过快地产生抗药性，生物防治已成为大豆疫病防治的重要方法。从大豆疫霉生存的土壤中筛选具有高拮抗活性和易定殖的生物防治菌株，对其进行形态学和分子生物学鉴定，并提取其产生的拮抗物质进行理化特性研究，以期为大豆疫霉根腐病防治提供新的拮抗菌资源，也为开发出新型微生物源农药提供基础。
1 材料与方法
供试培养基
R2A培养基：酵母粉（Yeast Extract）0.5g，氯化钠（Nacl） 0.1g，水解酪蛋白0.25g，葡萄糖（Glucose）0.65g，可溶性淀粉0.5g，酸水解酪素0.5g，磷酸氢二钾（K2HPO4）0.3g，水合硫酸镁（MgSO4?7H2O）0.024g，琼脂（Agar）15g，蒸馏水定容至1L，PH 7.2。WA培养基：蛋白胨5g，葡萄糖（Glucose）10g，牛肉浸膏3g，氯化钠（Nacl）5g，琼脂（Agar）20g，蒸馏水定容至1 L，pH 6.8。PDA培养基：土豆（Potato）200g，葡萄糖（Glucose）10g，琼脂（Agar）16.0g，蒸馏水定容至1L，PH 7.2。PD培养基：土豆（Potato）200g，葡萄糖（Glucose）10g，，蒸馏水定容至1L，PH 7.2。YPG培养基：Yeast Extract 5 g，Peptone 5 g，Glucose 10 g，加入水溶解，最后定容至1L，调pH 7.07.2。蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉6.4 g，溶于240 mL水中，121℃灭菌1 min；B：琼脂（Agar）6.4 g，定容至240 mL。纤维素酶检测培养基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，羧甲基纤维素钠10 g，氯化钠5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂（Agar）18 g，定容至1L，pH7.0。嗜铁素检测培养基：A：60.5mg CAS 溶于50mL去离子水；B：10mL三价铁溶液（1mM FeCl3?6H2O 盐酸为溶剂）；C：72.9mg HDTMA 溶于40mL 去离子水。上述三个溶液混合定容至100mL，pH调至中性。121℃灭菌20 min后，加入900mL的WA培养基中，混合倒平板。明胶琼脂培养基：明胶4g，牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂15g，水1L，ph7.0~7.2。液体培养时不加琼脂。
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