caffeoylshikimateesteraselike基因在棉花转基因材料中的表达验证
棉花是一种重要的纤维作物，在国民经济中有着重要的地位。纤维长度是在棉花纤维的伸长发育期决定的。实验室前期通过基因芯片筛选出的Caffeoyl Shikimate Esterase Like（CSEL）基因，用RNA-seq分析发现在棉纤维伸长期表达含量显著升高，推测CSEL基因可能与棉纤维长度及棉纤维品质有关。我们以过量表达与反义表达策略构建转基因载体，以W0棉花为受体进行转基因，目前得到T4代转基因棉花材料。利用实时荧光定量PCR技术检测CSEL基因在不同转基因克隆材料的开花后8天纤维中相对基因表达量，并与转基因棉花的纤维品质检测结果进行对比分析和相关性分析。研究数据表明，CSEL在正义表达株系中的高表达可能与纤维的长度有一定的正相关性，故推测CSEL基因可能存在促进纤维伸长的功能。由于样本数量小，需要加大群体数量以支持正确的统计分析结论。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法3
1.1 植物材料 3
1.2 载体 3
1.3 主要试剂用品3
1.4 棉花叶片DNA提取4
1.5 卡那检测及PCR扩增产物的电泳4
1.6 棉花纤维RNA提取5
1.7 RTPCR验证5
1.8 荧光定量PCR6
1.9 定量数据分析6
1.10 引物设计表6
1.11 统计学分析7
2 结果与分析7
2.1 转基因棉花CSEL基因表达量分析7
2.2 转基因棉花纤维产量性状分析8
2.3 转基因棉花纤维品质性状分析8
3 讨论 10
3.1 CSEL基因有促进棉花纤维伸长的潜力10
3.2实验样本群体小，现有数据不足以支持得到正确的统计分析10
3.3反义表达载体在植株中表达量过高10
致谢10
参考文献11
附表一12
附表二12
Caffeoyl Shikimate Esterase Like
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
基因
在棉花转基因材料中的表达验证
引言
棉花在植物学分类上属于被子植物门（Angiospermae）、双子叶植物纲（Dicotyledoneae）、锦葵目（Malvales）、锦葵科（Malvaceae）、棉属（Gossypium），共包含51个种，一般是一年生的亚灌木[1] [2] [3]。棉花是世界上是主要农作物之一，它不仅是纤维作物、油料作物、粮食作物，还是一种蜜源植物，更是纺织、化工和医药等产业的原料。棉花的主要成分是纤维，纤维的品质构成要素有纤维细度、长度、强度、整齐度等[4]，而这些性状主要是受基因型控制。传统的品质改良主要集中在杂交育种，但是因其具有改良周期长、优质性状与产量负相关以及无法预见后代表型等缺点，所以利用基因工程改良棉花纤维品质是很重要的技术方式。因此阐明纤维发育的细胞分子机理，找到改良棉花纤维品质的基因，是改良棉纤维品质的基础，有着重要的意义[5]。
由于棉纤维在经济中的重要地位，国内外对其研究并不少。对于棉花基因的功能验证，主要集中在棉纤维特异表达和优势表达基因的克隆和验证。棉纤维发育过程中有数千个活跃的基因[6]。到目前为止，国内外研究中已经发现的重要的棉纤维发育相关基因有：与纤维伸长相关的GhPRP1[7]、Expansin[8]、Tubulin [9]、GhAGPs[10]、GhACT1[11]基因等；与纤维细胞壁合成有关的三个纤维素合成酶基因CELA1、CELA2和CELA3[12] [13]、Rac蛋白基因[14]、蔗糖合成酶（SuSy）基因[15]等。这些基因大多是在棉纤维细胞中特异表达或者优势表达，只有极少部分进行了功能鉴定，但是没有发现单一的起关键作用的基因，这说明棉纤维的发育受到一系列基因的调控。
棉花纤维是由胚珠外珠被的单个细胞伸长发育而来的，其伸长发育共分为四个时期，纤维细胞起始分化期（Initiation）、纤维细胞迅速伸长期（Elongation）、次生壁合成期（Secondary cell wall synthesis）和脱水成熟期（Maturation）[16] [17]。这四个时期的界限并不是特别分明，是存在交叉重叠的，其中起始分化期决定着纤维的数量，伸长期决定着纤维的长度，次生壁合成情况则与纤维的强度、马克隆值等性状相关。棉花在开花当天，棉纤维发育就进入了伸长期，并持续到25 DPA，在10 12 DPA时伸长速率达到最大，为2 mm/d[18]。棉纤维的伸长一般可达到20 30 mm，是其直径的1000 3000倍，陆地棉的棉纤维可以达到30 40 mm长[19]。现阶段，被大家广泛接受的棉纤维伸长机制是由阮永玲等人提出的，主要有三个途径，其一是通过糖转运蛋白将糖类物质运输到纤维细胞中，其二是钾离子和钙离子泵转运钾离子和钙离子进入纤维细胞中，其三是胞间连丝通道打开，利于物质运输到纤维细胞内，这三种模式存在于纤维伸长的不同时间段[20]。细胞膜是主要成分是甘油磷脂（Glyceryl Phosphatide, GPLs），GPLs 的从头合成是一个碳（C）原子守恒的过程[21]，GPLs进一步可以分为磷脂酸（Phosphatidic Acid, PA）、磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine, PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl Ethanolamine, PE）、磷酯酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）、磷脂酰甘油（Phosphatidyl Glycerol, PG）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol, PI）。磷脂酰肌醇磷酸（Phosphatidyl Inositol Phosphate，PIP）是PI的4位上的羟基发生磷酸化作用形成的PI4P。有人发现纤维细胞比胚珠中含有更多的磷脂类物质，并验证了PI PIP信号可以促进纤维细胞伸长[22]。
类咖啡酰莽草酸酯酶Caffeoyl Shikimate Esterase Like（CSEL）基因是本实验室前期通过分析棉纤维不同发育时期的基因芯片，通过筛选表达差异较大的基因得到的，获得其EST序列后克隆得到CSEL基因。CSEL基因全长1017 bp，共编码339个氨基酸，将CSEL基因进行Blast比对以及进行NCBI上的Conserved Domain Database（CDD）分析，发现在序列的41121位置有一个保守区域，很多人将其注释为溶血磷脂酶（Lysophospholipase）。在Dorlands Medical Dictionary中，根据序列分析及磷脂酶水解甘油磷脂位点将磷脂酶分为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D。由此我们推测CSEL编码的是溶血磷脂酶B，溶血磷脂酶B是一类同时具有磷脂酶A1（PLA1）和磷脂酶A2（PLA2）功能的磷脂酶[23]。在他人之前的研究中，我们了解到Lee 等人发现过量表达PLA2β可以促进拟南芥下胚轴伸长[24]，并且Lee 等人在研究PIN 转基因拟南芥时发现，添加PLA2抑制剂ONORS082后恢复了由于超量表达PIN蛋白引起的根毛发育受抑制的情况，能够让根毛生长回归正常[25]。佘玉罕下调表达了PLA2α和PLA2β发现抑制了纤维伸长[26]，成熟纤维变短，并认为PLA2α和PLA2β参与了棉花纤维细胞的快速伸长。同时实验室前期利用RNAseq分析发现CSEL基因在5 DPA 10 DPA的纤维中的表达量突然升高，该时期又恰好是纤维的伸长发育期，所以我们推测CSEL基因编码一个溶血磷脂酶B并可能与棉纤维伸长发育有关，然后进行相关研究分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法3
1.1 植物材料 3
1.2 载体 3
1.3 主要试剂用品3
1.4 棉花叶片DNA提取4
1.5 卡那检测及PCR扩增产物的电泳4
1.6 棉花纤维RNA提取5
1.7 RTPCR验证5
1.8 荧光定量PCR6
1.9 定量数据分析6
1.10 引物设计表6
1.11 统计学分析7
2 结果与分析7
2.1 转基因棉花CSEL基因表达量分析7
2.2 转基因棉花纤维产量性状分析8
2.3 转基因棉花纤维品质性状分析8
3 讨论 10
3.1 CSEL基因有促进棉花纤维伸长的潜力10
3.2实验样本群体小，现有数据不足以支持得到正确的统计分析10
3.3反义表达载体在植株中表达量过高10
致谢10
参考文献11
附表一12
附表二12
Caffeoyl Shikimate Esterase Like
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
基因
在棉花转基因材料中的表达验证
引言
棉花在植物学分类上属于被子植物门（Angiospermae）、双子叶植物纲（Dicotyledoneae）、锦葵目（Malvales）、锦葵科（Malvaceae）、棉属（Gossypium），共包含51个种，一般是一年生的亚灌木[1] [2] [3]。棉花是世界上是主要农作物之一，它不仅是纤维作物、油料作物、粮食作物，还是一种蜜源植物，更是纺织、化工和医药等产业的原料。棉花的主要成分是纤维，纤维的品质构成要素有纤维细度、长度、强度、整齐度等[4]，而这些性状主要是受基因型控制。传统的品质改良主要集中在杂交育种，但是因其具有改良周期长、优质性状与产量负相关以及无法预见后代表型等缺点，所以利用基因工程改良棉花纤维品质是很重要的技术方式。因此阐明纤维发育的细胞分子机理，找到改良棉花纤维品质的基因，是改良棉纤维品质的基础，有着重要的意义[5]。
由于棉纤维在经济中的重要地位，国内外对其研究并不少。对于棉花基因的功能验证，主要集中在棉纤维特异表达和优势表达基因的克隆和验证。棉纤维发育过程中有数千个活跃的基因[6]。到目前为止，国内外研究中已经发现的重要的棉纤维发育相关基因有：与纤维伸长相关的GhPRP1[7]、Expansin[8]、Tubulin [9]、GhAGPs[10]、GhACT1[11]基因等；与纤维细胞壁合成有关的三个纤维素合成酶基因CELA1、CELA2和CELA3[12] [13]、Rac蛋白基因[14]、蔗糖合成酶（SuSy）基因[15]等。这些基因大多是在棉纤维细胞中特异表达或者优势表达，只有极少部分进行了功能鉴定，但是没有发现单一的起关键作用的基因，这说明棉纤维的发育受到一系列基因的调控。
棉花纤维是由胚珠外珠被的单个细胞伸长发育而来的，其伸长发育共分为四个时期，纤维细胞起始分化期（Initiation）、纤维细胞迅速伸长期（Elongation）、次生壁合成期（Secondary cell wall synthesis）和脱水成熟期（Maturation）[16] [17]。这四个时期的界限并不是特别分明，是存在交叉重叠的，其中起始分化期决定着纤维的数量，伸长期决定着纤维的长度，次生壁合成情况则与纤维的强度、马克隆值等性状相关。棉花在开花当天，棉纤维发育就进入了伸长期，并持续到25 DPA，在10 12 DPA时伸长速率达到最大，为2 mm/d[18]。棉纤维的伸长一般可达到20 30 mm，是其直径的1000 3000倍，陆地棉的棉纤维可以达到30 40 mm长[19]。现阶段，被大家广泛接受的棉纤维伸长机制是由阮永玲等人提出的，主要有三个途径，其一是通过糖转运蛋白将糖类物质运输到纤维细胞中，其二是钾离子和钙离子泵转运钾离子和钙离子进入纤维细胞中，其三是胞间连丝通道打开，利于物质运输到纤维细胞内，这三种模式存在于纤维伸长的不同时间段[20]。细胞膜是主要成分是甘油磷脂（Glyceryl Phosphatide, GPLs），GPLs 的从头合成是一个碳（C）原子守恒的过程[21]，GPLs进一步可以分为磷脂酸（Phosphatidic Acid, PA）、磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine, PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl Ethanolamine, PE）、磷酯酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）、磷脂酰甘油（Phosphatidyl Glycerol, PG）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol, PI）。磷脂酰肌醇磷酸（Phosphatidyl Inositol Phosphate，PIP）是PI的4位上的羟基发生磷酸化作用形成的PI4P。有人发现纤维细胞比胚珠中含有更多的磷脂类物质，并验证了PI PIP信号可以促进纤维细胞伸长[22]。
类咖啡酰莽草酸酯酶Caffeoyl Shikimate Esterase Like（CSEL）基因是本实验室前期通过分析棉纤维不同发育时期的基因芯片，通过筛选表达差异较大的基因得到的，获得其EST序列后克隆得到CSEL基因。CSEL基因全长1017 bp，共编码339个氨基酸，将CSEL基因进行Blast比对以及进行NCBI上的Conserved Domain Database（CDD）分析，发现在序列的41121位置有一个保守区域，很多人将其注释为溶血磷脂酶（Lysophospholipase）。在Dorlands Medical Dictionary中，根据序列分析及磷脂酶水解甘油磷脂位点将磷脂酶分为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D。由此我们推测CSEL编码的是溶血磷脂酶B，溶血磷脂酶B是一类同时具有磷脂酶A1（PLA1）和磷脂酶A2（PLA2）功能的磷脂酶[23]。在他人之前的研究中，我们了解到Lee 等人发现过量表达PLA2β可以促进拟南芥下胚轴伸长[24]，并且Lee 等人在研究PIN 转基因拟南芥时发现，添加PLA2抑制剂ONORS082后恢复了由于超量表达PIN蛋白引起的根毛发育受抑制的情况，能够让根毛生长回归正常[25]。佘玉罕下调表达了PLA2α和PLA2β发现抑制了纤维伸长[26]，成熟纤维变短，并认为PLA2α和PLA2β参与了棉花纤维细胞的快速伸长。同时实验室前期利用RNAseq分析发现CSEL基因在5 DPA 10 DPA的纤维中的表达量突然升高，该时期又恰好是纤维的伸长发育期，所以我们推测CSEL基因编码一个溶血磷脂酶B并可能与棉纤维伸长发育有关，然后进行相关研究分析。
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