水稻细菌性条斑病菌三个xop基因功能研究相关载体的构建
水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病和细菌性条斑病对稻米的生产造成很大威胁，两种病害分别由稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻黄单胞稻生致病变种（ X.o.pv. oryzicola , Xoc）侵染危害造成。病原菌的三型分泌系统分泌的效应因子在致病过程中发挥着重要作用，这些效应因子包括转录激活因子TALE和non-TALE因子Xop蛋白（Xanthomonas outer protein）,TALE基因主要通过结合在寄主基因的启动子上激活寄主基因的表达来调控感病基因或抗病基因的表达，决定互作是抗病还是感病表型；而Xop蛋白的主要功能是调控寄主植物的防卫反应信号，在细菌-水稻的互作中也具有重要作用。单个单胞菌中有40多个该类蛋白，大多数Xop蛋白的功能还不清楚。本实验为了研究其中三个细菌性条斑病菌特有的Xop基因的功能，构建成功了基因的回补、基因编码蛋白的泌出、基因编码蛋白的亚细胞定位检测、互作蛋白的免疫共沉淀筛选以及启动子功能相关研究的载体，为后续研究准备了关键的19个遗传学材料。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1PCR扩增目的条带 4
1.1.1引物的设计4
1.1.2 PCR体系5
1.1.3 PCR程序6
1.1.4电泳配胶6
1.1.5切胶回收6
1.1.6 TA克隆及质粒DNA的提取6
1.2目的片段连接至功能验证载体 8
1.2.1酶切8
1.2.2连接8
1.2.3转化8
1.2.4培养基9
1.2.5抗生素9
1.2.6 PCR验证9
2结果与分析10
2.1 PCR获得目的条带10
2.2目的片段酶切10
2.3连接至对应载体筛选出目的片段10
3讨论 13
致谢13
参考文献13
水稻细菌性条斑病菌三个Xop基因功能研究相关载体的构建 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
引言
引言：植物在生长过程中会遭受各种生物和非生物的胁迫，其中病原微生物作为重要的生物胁迫受到科学家广泛地关注[1]。植物在与病原微生物的长期相互作用过程中进化出两套防御系统抵御病原物侵入[2]。其中第一层是由一些保守的病原/微生物相关分子模式（Pathogen/ Microbeassociated molecular patterns,PAMPs/MAMPs）所激发的防御反应[3]（PAMP triggered immunity,PTI），植物识别细胞表面的细菌鞭毛蛋白、脂多糖等从而产生活性氧 (Reactive oxygen species,ROS)迸发[4]、丝裂原激活蛋白激酶（Motigenactivated protein kinase, MAPK）信号传导、病程相关基因（Pathogenesisrelated gene,PRgene）的表达以及胼胝质（callose depositions）的沉积以抵抗病原微生物的侵入[5]。第二层是由植物抗性（R）基因编码的 R 蛋白识别病原微生物分泌的无毒基因编码的效应蛋白（effector proteins）从而激发的防御反应（Effectortriggered immunity, ETI），在侵染位置产生快速的细胞死亡即超敏反应（Hypersensitive response,HR）以限制病原物的增殖[6]。植物通过 PTI 抵抗绝大部分病原菌的侵染，而革兰氏阴性病原菌为了克服植物的先天性屏障进化出三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system, T3SS）,通过三型效应系统将三型效应蛋白 （Type Ⅲ effector proteins,T3Es）注入到寄主细胞中靶定到不同的细胞区室以干扰细胞活动从而促进其繁殖扩增[1]。植物为了应对三型效应蛋白对防御系统的干扰进化出可以识别效应蛋白的抗性（Resistance,R）蛋白，产生 HR 快速抑制病原物生长[7]。三型效应蛋白包括TAL 效应因子和 NonTAL 效应因子，后者也叫做黄单胞菌外泌蛋白（Xanthomonas outer protein,XOP）。TAL 效应因子具有保守的转录激活因子的结构，而NonTAL 效应因子一般具有各种酶活功能，但蛋白之间序列没有保守性[8]。这类效应因子广泛存在于革兰氏阴性病原菌，黄单胞菌中包含至少 40 类外蛋白（ Xanthomonas outer protein,Xop）,而大量的水稻黄单胞菌 Xop 功能未知[9]。水稻黄单胞白叶枯病菌和细菌性条斑病菌含有的nonTAL基因大多数是相同的，但在还发现细菌性条斑病菌中含三个特有的Xop基因，我们猜想这三个基因在细菌水稻的互作中应该具有重要作用，因此我们设计构建基因的回补、基因编码的亚细胞定位、基因编码蛋白的泌出检测、互作蛋白的免疫共沉淀筛选以及启动子功能研究的相关载体，为后续研究准备了关键材料[10]。
1 材料与方法
1.1PCR扩增目的条带
扩增片段1：
240 xopAF pro u（EcoRI）gaattcCGCCAGCTTCGCATCCA
241 xopAF pro d（ApaI）gggcccGTGAGTCATTCATTGCCCAGT
240+241扩增片段大小：453bp
用途：扩增xopAF启动子，后反向连接到pHM1 lacZ 启动子下，消除pHM1 lacZ启动子的影响，xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达，观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达
扩增片段2：
242 xopAF pro u（HindIII）aagcttCGCCAGCTTCGCATCCA
243 xopAF pro d（NcoI）ccatggGTGAGTCATTCATTGCCCAGT
242+243扩增片段大小：453bp
用途：扩增xopAF启动子，后直接连接到1300NG载体，xopAF启动子融合gusA表达，瞬时转化烟草，观察xopAF启动子在植物中被诱导表达
扩增片段3：
244 xopAF pro+CDSu(ApaI）gggcccCGCCAGCTTCGCATCCA
245 xopAF pro+CDS+flagd(BglII)agatct TTA TCA CTT ATC GTC GTC ATC CT TGTA ATC ATCGCGGAGCTGCTCCGTA
244+245扩增片段大小1.3kb
用途：扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签，连接到PHM1，转入xopAF突变体，用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1PCR扩增目的条带 4
1.1.1引物的设计4
1.1.2 PCR体系5
1.1.3 PCR程序6
1.1.4电泳配胶6
1.1.5切胶回收6
1.1.6 TA克隆及质粒DNA的提取6
1.2目的片段连接至功能验证载体 8
1.2.1酶切8
1.2.2连接8
1.2.3转化8
1.2.4培养基9
1.2.5抗生素9
1.2.6 PCR验证9
2结果与分析10
2.1 PCR获得目的条带10
2.2目的片段酶切10
2.3连接至对应载体筛选出目的片段10
3讨论 13
致谢13
参考文献13
水稻细菌性条斑病菌三个Xop基因功能研究相关载体的构建 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
引言
引言：植物在生长过程中会遭受各种生物和非生物的胁迫，其中病原微生物作为重要的生物胁迫受到科学家广泛地关注[1]。植物在与病原微生物的长期相互作用过程中进化出两套防御系统抵御病原物侵入[2]。其中第一层是由一些保守的病原/微生物相关分子模式（Pathogen/ Microbeassociated molecular patterns,PAMPs/MAMPs）所激发的防御反应[3]（PAMP triggered immunity,PTI），植物识别细胞表面的细菌鞭毛蛋白、脂多糖等从而产生活性氧 (Reactive oxygen species,ROS)迸发[4]、丝裂原激活蛋白激酶（Motigenactivated protein kinase, MAPK）信号传导、病程相关基因（Pathogenesisrelated gene,PRgene）的表达以及胼胝质（callose depositions）的沉积以抵抗病原微生物的侵入[5]。第二层是由植物抗性（R）基因编码的 R 蛋白识别病原微生物分泌的无毒基因编码的效应蛋白（effector proteins）从而激发的防御反应（Effectortriggered immunity, ETI），在侵染位置产生快速的细胞死亡即超敏反应（Hypersensitive response,HR）以限制病原物的增殖[6]。植物通过 PTI 抵抗绝大部分病原菌的侵染，而革兰氏阴性病原菌为了克服植物的先天性屏障进化出三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system, T3SS）,通过三型效应系统将三型效应蛋白 （Type Ⅲ effector proteins,T3Es）注入到寄主细胞中靶定到不同的细胞区室以干扰细胞活动从而促进其繁殖扩增[1]。植物为了应对三型效应蛋白对防御系统的干扰进化出可以识别效应蛋白的抗性（Resistance,R）蛋白，产生 HR 快速抑制病原物生长[7]。三型效应蛋白包括TAL 效应因子和 NonTAL 效应因子，后者也叫做黄单胞菌外泌蛋白（Xanthomonas outer protein,XOP）。TAL 效应因子具有保守的转录激活因子的结构，而NonTAL 效应因子一般具有各种酶活功能，但蛋白之间序列没有保守性[8]。这类效应因子广泛存在于革兰氏阴性病原菌，黄单胞菌中包含至少 40 类外蛋白（ Xanthomonas outer protein,Xop）,而大量的水稻黄单胞菌 Xop 功能未知[9]。水稻黄单胞白叶枯病菌和细菌性条斑病菌含有的nonTAL基因大多数是相同的，但在还发现细菌性条斑病菌中含三个特有的Xop基因，我们猜想这三个基因在细菌水稻的互作中应该具有重要作用，因此我们设计构建基因的回补、基因编码的亚细胞定位、基因编码蛋白的泌出检测、互作蛋白的免疫共沉淀筛选以及启动子功能研究的相关载体，为后续研究准备了关键材料[10]。
1 材料与方法
1.1PCR扩增目的条带
扩增片段1：
240 xopAF pro u（EcoRI）gaattcCGCCAGCTTCGCATCCA
241 xopAF pro d（ApaI）gggcccGTGAGTCATTCATTGCCCAGT
240+241扩增片段大小：453bp
用途：扩增xopAF启动子，后反向连接到pHM1 lacZ 启动子下，消除pHM1 lacZ启动子的影响，xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达，观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达
扩增片段2：
242 xopAF pro u（HindIII）aagcttCGCCAGCTTCGCATCCA
243 xopAF pro d（NcoI）ccatggGTGAGTCATTCATTGCCCAGT
242+243扩增片段大小：453bp
用途：扩增xopAF启动子，后直接连接到1300NG载体，xopAF启动子融合gusA表达，瞬时转化烟草，观察xopAF启动子在植物中被诱导表达
扩增片段3：
244 xopAF pro+CDSu(ApaI）gggcccCGCCAGCTTCGCATCCA
245 xopAF pro+CDS+flagd(BglII)agatct TTA TCA CTT ATC GTC GTC ATC CT TGTA ATC ATCGCGGAGCTGCTCCGTA
244+245扩增片段大小1.3kb
用途：扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签，连接到PHM1，转入xopAF突变体，用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/197.html
