胡萝卜软腐果胶杆菌钼酸盐转运系统基因功能研究
摘要：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc)能引起多种植物的细菌性软腐病。其寄主广泛，防治比较困难。目前，与Pcc 致病相关的各种植物细胞降解酶的产生、调节、分泌及相应的表达基因已经得到了一定的研究，为了更加深入的了解其致病机制，本研究前期开展了Pcc与活体和离体寄主的互作研究，发现了多个显著差异表达的蛋白，钼酸盐转运相关蛋白（molybdenum ABC transporter protein）是其中之一。本研究利用基因缺失突变技术，构建了钼酸盐转运相关基因（modA、modB、modC、modE和modF）的缺失突变体并检测其致病性，结果显示，单独缺失任何一个基因都不能影响菌株的致病性，而全部相关基因缺失后，与野生型相比，突变体的致病力显著下降，说明Mod系列蛋白共同作用下对致病性产生了显著影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1供试菌株和质粒2
1.1.1菌株和质粒2
1.1.2 菌株培养条件及保存2
1.2 培养基和抗生素3
1.2.1培养基3
1.2.2抗生素3
1.3 试验试剂及器材3
1.3.1 试剂3
1.3.2 引物3
1.3.3 器材3
1.4 试验方法3
1.4.1 PccS1与?modA、?modB、?modC、?modE、?modF的致病性研究3
1.4.2mod定向缺失敲除3
1.4.2.1 引物设计3
1.4.2.2 引物稀释4
1.4.2.3 PCR确定引物最适退火温度4
1.4.2.4酶切4
1.4.2.5连接 4
1.4.2.6转化I 5
1.4.2.7提取质粒5
1.4.2.8酶切验证6
1.4.2.9转化II6
1.4.2.10两亲6
1.4.2.1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
1洗膜7
1.4.2.12一次交换子的筛选7
1.4.2.13二次交换子的筛选7
1.4.2 白菜致病性试验7
2 结果与分析7
2.1 ?modA、?modB、?modC、?modE、?modF的白菜致病性8
2.2重组载体的构建8
2.3突变体筛选及验证9
2.4 ?modABCEF的白菜致病性10
3讨论10
致谢11
参考文献11
胡萝卜软腐果胶杆菌钼酸盐转运系统基因功能研究
引言
细菌性软腐病是一种常见的而且危害非常严重的世界性重要病害。在我国曾引起过农作物的严重经济损失[1,2]。引起细菌性软腐病的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pcc，1998年前为Erwinia carotovora subsp. carotovora)、菊欧文氏菌(Dickeya dadantii，1998年前为 E. chrysanthemi) [35] 和胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种 (Pectobacterterium carotovorum subsp. Atroseptica，1998年前为E. carotovora subsp. atroseptica) 。其中，胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pcc）是导致植物细菌性软腐病的最主要病原菌。Pcc菌体呈棒状，大小0.5～1.0×2.2～3.0 μm，革兰氏阴性细菌，单生或具26 根周生鞭毛，无荚膜，不产生芽孢[6]。兼性厌氧型，生长温度在237 ℃，最适温度是2528 ℃，在超过50 ℃时无法存活。最适pH为7.2，pH 在5.3~9.2均可生长；光照、干燥不利于其存活，在太阳光下曝晒2 h，会引起大部分菌体的死亡。脱离寄主，可在土壤中单独存活约15天[7,8]。用普通肉汁培养基培养，其菌落呈半透明状，灰白色，表面较光滑，边缘整齐，菌落微微凸起，圆形或不定形。Pcc寄主广泛，包括大白菜、马铃薯、马蹄莲和胡萝卜等，也能引起多种水果蔬菜贮藏期腐烂[9]。Pcc侵染引起的软腐病病斑边缘起初会具有明显的界限，随着病势的发展病斑与健康组织的界限逐渐模糊，最后导致植株的全部软腐。植物在被侵染的初期，受害部位会出现水浸状的坏死，然后病部迅速扩展，进而病组织出现变色、凹陷、软化等症状。地下块根如果受到病原菌的侵染会导致植株地上部的叶片呈现系统性的黄化，随着病菌的扩展，会最终引起植株的死亡[10]，在植株内部可能已经腐烂并形成浑浊粘稠的液体，但其外表完整；当叶片受到侵染时，在叶片表面会出现水浸状不规则的病斑并向四周扩展，最终致使叶片腐烂。
软腐病一直都是植物病理学研究的重要内容之一，尤其是在其全基因序列公布后，与其致病相关的研究更有所增加[11]。modA、modB、modC、modE、modF基因编码的modA、modB、modC、modE、modF蛋白属于ABC（ATPbinding cattle）转运蛋白复合体的膜外钼酸盐结合蛋白[12,13]。ABC转运蛋白复合体是一类广泛存在于古细菌、细菌及真核生物中的转运蛋白家族，其转运底物类型丰富，包括糖类、离子、蛋白、固醇等。钼是细菌生长中重要的微量元素之一，通常以钼酸盐的形式被吸收[14]。钼酸盐能够与喋呤结合形成钼酸盐辅助因子（Moco），是许多含Mo酶（如亚硫酸盐氧化酶、黄嘌呤氧化酶、亚硝酸盐还原酶、醛氧化酶等）的催化位点，影响着细菌的固氮反应、嘌呤代谢及植物的亚硫酸盐的解毒作用等许多重要的生理过程[14,15]。本研究对modA、modB、modC、modE、modF单基因突变体进行了致病性检测，结果显示，单独缺失其中任何一个基因都不会影响致病性，为了进一步探究基因定向敲除突变体对致病性的影响，本研究通过对细菌进行钼酸盐转运系统mod基因进行多基因敲除，得到了基因缺失突变体ΔmodABCEF，并对突变体进行致病性检测，结果显示突变体与野生型相比，对寄主白菜的致病性减弱，说明mod的缺失突变体能减弱菌株PccS1的致病能力。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1 本实验所需菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains and plasmids
Characteristics
Source
Escherichia coli
Top10
Standard cloning host
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
PccS1
Wild type, RifR
Lab collection
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1供试菌株和质粒2
1.1.1菌株和质粒2
1.1.2 菌株培养条件及保存2
1.2 培养基和抗生素3
1.2.1培养基3
1.2.2抗生素3
1.3 试验试剂及器材3
1.3.1 试剂3
1.3.2 引物3
1.3.3 器材3
1.4 试验方法3
1.4.1 PccS1与?modA、?modB、?modC、?modE、?modF的致病性研究3
1.4.2mod定向缺失敲除3
1.4.2.1 引物设计3
1.4.2.2 引物稀释4
1.4.2.3 PCR确定引物最适退火温度4
1.4.2.4酶切4
1.4.2.5连接 4
1.4.2.6转化I 5
1.4.2.7提取质粒5
1.4.2.8酶切验证6
1.4.2.9转化II6
1.4.2.10两亲6
1.4.2.1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
1洗膜7
1.4.2.12一次交换子的筛选7
1.4.2.13二次交换子的筛选7
1.4.2 白菜致病性试验7
2 结果与分析7
2.1 ?modA、?modB、?modC、?modE、?modF的白菜致病性8
2.2重组载体的构建8
2.3突变体筛选及验证9
2.4 ?modABCEF的白菜致病性10
3讨论10
致谢11
参考文献11
胡萝卜软腐果胶杆菌钼酸盐转运系统基因功能研究
引言
细菌性软腐病是一种常见的而且危害非常严重的世界性重要病害。在我国曾引起过农作物的严重经济损失[1,2]。引起细菌性软腐病的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pcc，1998年前为Erwinia carotovora subsp. carotovora)、菊欧文氏菌(Dickeya dadantii，1998年前为 E. chrysanthemi) [35] 和胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种 (Pectobacterterium carotovorum subsp. Atroseptica，1998年前为E. carotovora subsp. atroseptica) 。其中，胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pcc）是导致植物细菌性软腐病的最主要病原菌。Pcc菌体呈棒状，大小0.5～1.0×2.2～3.0 μm，革兰氏阴性细菌，单生或具26 根周生鞭毛，无荚膜，不产生芽孢[6]。兼性厌氧型，生长温度在237 ℃，最适温度是2528 ℃，在超过50 ℃时无法存活。最适pH为7.2，pH 在5.3~9.2均可生长；光照、干燥不利于其存活，在太阳光下曝晒2 h，会引起大部分菌体的死亡。脱离寄主，可在土壤中单独存活约15天[7,8]。用普通肉汁培养基培养，其菌落呈半透明状，灰白色，表面较光滑，边缘整齐，菌落微微凸起，圆形或不定形。Pcc寄主广泛，包括大白菜、马铃薯、马蹄莲和胡萝卜等，也能引起多种水果蔬菜贮藏期腐烂[9]。Pcc侵染引起的软腐病病斑边缘起初会具有明显的界限，随着病势的发展病斑与健康组织的界限逐渐模糊，最后导致植株的全部软腐。植物在被侵染的初期，受害部位会出现水浸状的坏死，然后病部迅速扩展，进而病组织出现变色、凹陷、软化等症状。地下块根如果受到病原菌的侵染会导致植株地上部的叶片呈现系统性的黄化，随着病菌的扩展，会最终引起植株的死亡[10]，在植株内部可能已经腐烂并形成浑浊粘稠的液体，但其外表完整；当叶片受到侵染时，在叶片表面会出现水浸状不规则的病斑并向四周扩展，最终致使叶片腐烂。
软腐病一直都是植物病理学研究的重要内容之一，尤其是在其全基因序列公布后，与其致病相关的研究更有所增加[11]。modA、modB、modC、modE、modF基因编码的modA、modB、modC、modE、modF蛋白属于ABC（ATPbinding cattle）转运蛋白复合体的膜外钼酸盐结合蛋白[12,13]。ABC转运蛋白复合体是一类广泛存在于古细菌、细菌及真核生物中的转运蛋白家族，其转运底物类型丰富，包括糖类、离子、蛋白、固醇等。钼是细菌生长中重要的微量元素之一，通常以钼酸盐的形式被吸收[14]。钼酸盐能够与喋呤结合形成钼酸盐辅助因子（Moco），是许多含Mo酶（如亚硫酸盐氧化酶、黄嘌呤氧化酶、亚硝酸盐还原酶、醛氧化酶等）的催化位点，影响着细菌的固氮反应、嘌呤代谢及植物的亚硫酸盐的解毒作用等许多重要的生理过程[14,15]。本研究对modA、modB、modC、modE、modF单基因突变体进行了致病性检测，结果显示，单独缺失其中任何一个基因都不会影响致病性，为了进一步探究基因定向敲除突变体对致病性的影响，本研究通过对细菌进行钼酸盐转运系统mod基因进行多基因敲除，得到了基因缺失突变体ΔmodABCEF，并对突变体进行致病性检测，结果显示突变体与野生型相比，对寄主白菜的致病性减弱，说明mod的缺失突变体能减弱菌株PccS1的致病能力。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1 本实验所需菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains and plasmids
Characteristics
Source
Escherichia coli
Top10
Standard cloning host
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
PccS1
Wild type, RifR
Lab collection
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