马铃薯甲虫nachr基因的表达谱分析
摘要：烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）是昆虫中枢神经系统中重要的神经递质受体，也是新烟碱类类药剂的作用靶标。本文在克隆获得几个马铃薯甲虫 nAChR基因的基础上，利用实时荧光定量PCR技术分析了这些基因及其它已知亚基基因在马铃薯甲虫不同生长发育阶段及其成虫不同部位的表达情况。结果表明，马铃薯甲虫nAChR亚基基因 Ldα1、Ldα2、Ldα3、Ldα6、Ldα8、Ldα10和Ldβ1主要集中于成虫的头部，而在胸部和腹部的表达水平较低。同时，各基因在卵、1~4龄幼虫、蛹和成虫中均有表达，但表达量有显著差异。Ldα1基因在卵、1-3龄幼虫中的表达量最高，Ldα2和Ldα6在卵和1-2龄幼虫中表达量最高，Ldα3和Ldβ1均在1龄幼虫中表达量最高，Ldα8和 Ldα10分别在2龄和4龄幼虫中表达量最高。通过对比这些亚基基因的表达量差异，推测这些基因在该虫不同生长发育阶段发挥特定作用。研究结果可为探明昆虫nAChR亚基功能及新烟碱类药剂的作用机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料和方法2
1.1试剂及仪器设备2
1.2供试昆虫2
1.3马铃薯甲虫总RNA的提取3
1．4 实时定量PCR引物设计 3
1.5 7个马铃薯甲虫nAChR基因在不同发育时期的表达 4
1.6 7个马铃薯甲虫nAChR基因在成虫不同体段中的表达 4
1.7 数据统计与分析 4
2 结果与分析 4
2.1 7个nAChR基因在马铃薯甲虫不同生长发育阶段的表达谱分析 4
2.2 7个nAChR基因在马铃薯甲虫成虫不同部位的表达谱分析 4
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
马铃薯甲虫nAChR基因的表达谱分析
引言
马铃薯甲虫（Leptinotarsa Decemlineata （Say））属鞘翅目叶甲科，英文名为Colorado potato beetle或Colorado beetle，是国际公认的毁灭性检疫害虫，也是我国
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
重要外来入侵物种之一 [1]。近年来，新烟碱类杀虫剂推广使用于防治马铃薯甲虫，其作用靶标为烟碱型乙酰胆碱受体。烟碱型乙酰胆碱受体 ( nicotinic acetylcholine receptor，nAChR) 广泛分布于昆虫的中央神经系统的突触神经纤维网区，在昆虫突触兴奋性神经传递过程当中具有重要功能，是新烟碱类杀虫剂及生物农药多杀菌素的作用靶标[2]。每个nAChR由5个亚基构成。不同的亚基构成不同的亚型受体，来表现不同的理化及药理特性，从而形成nAChR的多样性。与脊椎动物nAChR不同，昆虫中的nAChR只在神经系统中表达[3]。
马铃薯甲虫繁殖力强，寿命长，能较快适应新的寄主植物，对气候、药剂及生物因素适应能力也很强，其成虫和幼虫不仅取食植物叶片造成危害，并且还能传播褐斑病、环腐病等病害，造成农作物产量和品质的巨大损失[4]。因此，马铃薯甲虫一直以来都是作物生产上的重要防治对象。自1993年马铃薯甲虫侵入我国新疆伊犁以来，其发生区不断向东扩展，自2013年已在黑龙江省牡丹江市、鸡西市及辽宁省相继发现马铃薯甲虫新疫情[5]，可见我国马铃薯甲虫的防控形势十分严峻。长期以来，化学防治是有效控制该害虫的手段之一，而据文献报道，马铃薯甲虫对所有已注册化学农药均产生了抗药性，包括吡虫啉等目前生产上使用的主导杀虫剂[69]。对马铃薯甲虫而言，注册的化学农药往往在使用后2～3年就产生明显的抗药性，最快的当年即可产生抗性[10]，因此，研究马铃薯甲虫新的治理措施以及延缓和预防其抗药性的发生迫在眉睫。
nAChR的研究是近年来的热点。有学者对秀丽隐杆线虫基因组序列分析，发现至少存在27个nAChR亚基，并且某些亚基在神经和肌肉细胞中都存在，这预示着无脊椎动物亚基比脊椎动物更加丰富，在生物体内起到更加重要的作用[11]。近来，重要的农业害虫东亚飞蝗、褐飞虱、棉铃虫等的基因组测序陆续完成，为昆虫nAChR亚基基因的研究提供了丰富资源。但是，目前人们对马铃薯甲虫nAChR亚基组成及结构的相关研究甚少，前人已经克隆得到的基因仅有nAChRα1、nAChRα2和nAChRα8。这很大程度上阻碍了对马铃薯甲虫nAChR的作用机理及抗性机制的深入研究。课题组前期研究获得了马铃薯甲虫nAChR亚基基因Ldα4、Ldα7和Ldα9的cDNA全长序列并进行了表达谱分析[12]，近期克隆得到了Ldα3、Ldα6、Ldα10和Ld(1其它几个基因的全长cDNA（未发表），在此基础上，本研究利用实时定量PCR（qRTPCR）分析了马铃薯甲虫nAChR亚基基因Ldα1、Ldα2、Ldα3、Ldα6、Ldα8、Ldα10和Ldβ1的时空表达谱，为进一步阐明这些基因的分子特征和功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试剂及仪器设备
主要的仪器设备：ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems公司）、PCR 扩增仪PTC200（Thermocycler MJ research公司）；水平式核酸电泳仪（北京市六一仪器厂）；超低温冰箱FORMA 906（美国Thermo Electron公司）；制冰机SIMF124（日本SANYO公司）；超纯水器E1IX10（美国Millipore公司）；A2型生物安全柜1285（国Thermo Electron公司）；Nanodrop核酸定量仪（美国BioRad公司）；离心机Centrifuge 5424、离心机5145D（德国Eppendoff公司）。
主要试剂：TRIzol总RNA提取试剂盒，TAKARATM MMLV反转录试剂盒、荧光定量试剂盒 SYBR? Premix Ex Taq (Prefect Real Time)引物由南京英俊生物工程技术服务有限公司进行合成。
1.2 供试昆虫
马铃薯甲虫样品于2014年7月采自新疆乌鲁木齐安宁渠试验基地（43.71N, 87.39E）田间马铃薯苗上，在室内用马铃薯苗饲养。养虫室条件：温度28±1℃，相对湿度50%~60%，光周期为16L∶8D。接着对不同生长发育阶段的马铃薯甲虫，包括卵、14龄幼虫、蛹和成虫，及其成虫的不同部位，包括头部、胸部和腹部进行RNA提取及反转录的处理，冻存样品，运回南京进行后续试验。
1.3马铃薯甲虫总RNA的提取
按照Trizol试剂说明进行总RNA提取。操作步骤如下：
1) 样品加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
2) 12,000rpm 离心5min，取上清。
3) 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15s，混匀后室温静置10min。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料和方法2
1.1试剂及仪器设备2
1.2供试昆虫2
1.3马铃薯甲虫总RNA的提取3
1．4 实时定量PCR引物设计 3
1.5 7个马铃薯甲虫nAChR基因在不同发育时期的表达 4
1.6 7个马铃薯甲虫nAChR基因在成虫不同体段中的表达 4
1.7 数据统计与分析 4
2 结果与分析 4
2.1 7个nAChR基因在马铃薯甲虫不同生长发育阶段的表达谱分析 4
2.2 7个nAChR基因在马铃薯甲虫成虫不同部位的表达谱分析 4
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
马铃薯甲虫nAChR基因的表达谱分析
引言
马铃薯甲虫（Leptinotarsa Decemlineata （Say））属鞘翅目叶甲科，英文名为Colorado potato beetle或Colorado beetle，是国际公认的毁灭性检疫害虫，也是我国
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
重要外来入侵物种之一 [1]。近年来，新烟碱类杀虫剂推广使用于防治马铃薯甲虫，其作用靶标为烟碱型乙酰胆碱受体。烟碱型乙酰胆碱受体 ( nicotinic acetylcholine receptor，nAChR) 广泛分布于昆虫的中央神经系统的突触神经纤维网区，在昆虫突触兴奋性神经传递过程当中具有重要功能，是新烟碱类杀虫剂及生物农药多杀菌素的作用靶标[2]。每个nAChR由5个亚基构成。不同的亚基构成不同的亚型受体，来表现不同的理化及药理特性，从而形成nAChR的多样性。与脊椎动物nAChR不同，昆虫中的nAChR只在神经系统中表达[3]。
马铃薯甲虫繁殖力强，寿命长，能较快适应新的寄主植物，对气候、药剂及生物因素适应能力也很强，其成虫和幼虫不仅取食植物叶片造成危害，并且还能传播褐斑病、环腐病等病害，造成农作物产量和品质的巨大损失[4]。因此，马铃薯甲虫一直以来都是作物生产上的重要防治对象。自1993年马铃薯甲虫侵入我国新疆伊犁以来，其发生区不断向东扩展，自2013年已在黑龙江省牡丹江市、鸡西市及辽宁省相继发现马铃薯甲虫新疫情[5]，可见我国马铃薯甲虫的防控形势十分严峻。长期以来，化学防治是有效控制该害虫的手段之一，而据文献报道，马铃薯甲虫对所有已注册化学农药均产生了抗药性，包括吡虫啉等目前生产上使用的主导杀虫剂[69]。对马铃薯甲虫而言，注册的化学农药往往在使用后2～3年就产生明显的抗药性，最快的当年即可产生抗性[10]，因此，研究马铃薯甲虫新的治理措施以及延缓和预防其抗药性的发生迫在眉睫。
nAChR的研究是近年来的热点。有学者对秀丽隐杆线虫基因组序列分析，发现至少存在27个nAChR亚基，并且某些亚基在神经和肌肉细胞中都存在，这预示着无脊椎动物亚基比脊椎动物更加丰富，在生物体内起到更加重要的作用[11]。近来，重要的农业害虫东亚飞蝗、褐飞虱、棉铃虫等的基因组测序陆续完成，为昆虫nAChR亚基基因的研究提供了丰富资源。但是，目前人们对马铃薯甲虫nAChR亚基组成及结构的相关研究甚少，前人已经克隆得到的基因仅有nAChRα1、nAChRα2和nAChRα8。这很大程度上阻碍了对马铃薯甲虫nAChR的作用机理及抗性机制的深入研究。课题组前期研究获得了马铃薯甲虫nAChR亚基基因Ldα4、Ldα7和Ldα9的cDNA全长序列并进行了表达谱分析[12]，近期克隆得到了Ldα3、Ldα6、Ldα10和Ld(1其它几个基因的全长cDNA（未发表），在此基础上，本研究利用实时定量PCR（qRTPCR）分析了马铃薯甲虫nAChR亚基基因Ldα1、Ldα2、Ldα3、Ldα6、Ldα8、Ldα10和Ldβ1的时空表达谱，为进一步阐明这些基因的分子特征和功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试剂及仪器设备
主要的仪器设备：ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems公司）、PCR 扩增仪PTC200（Thermocycler MJ research公司）；水平式核酸电泳仪（北京市六一仪器厂）；超低温冰箱FORMA 906（美国Thermo Electron公司）；制冰机SIMF124（日本SANYO公司）；超纯水器E1IX10（美国Millipore公司）；A2型生物安全柜1285（国Thermo Electron公司）；Nanodrop核酸定量仪（美国BioRad公司）；离心机Centrifuge 5424、离心机5145D（德国Eppendoff公司）。
主要试剂：TRIzol总RNA提取试剂盒，TAKARATM MMLV反转录试剂盒、荧光定量试剂盒 SYBR? Premix Ex Taq (Prefect Real Time)引物由南京英俊生物工程技术服务有限公司进行合成。
1.2 供试昆虫
马铃薯甲虫样品于2014年7月采自新疆乌鲁木齐安宁渠试验基地（43.71N, 87.39E）田间马铃薯苗上，在室内用马铃薯苗饲养。养虫室条件：温度28±1℃，相对湿度50%~60%，光周期为16L∶8D。接着对不同生长发育阶段的马铃薯甲虫，包括卵、14龄幼虫、蛹和成虫，及其成虫的不同部位，包括头部、胸部和腹部进行RNA提取及反转录的处理，冻存样品，运回南京进行后续试验。
1.3马铃薯甲虫总RNA的提取
按照Trizol试剂说明进行总RNA提取。操作步骤如下：
1) 样品加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
2) 12,000rpm 离心5min，取上清。
3) 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15s，混匀后室温静置10min。
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