水稻白穗和矮秆基因的定位
水稻穗部距离籽粒较近，根据“源”“库”关系，小穗光合作用可能对水稻产量具有一定影响。本实验以对高产粳稻品种宁粳4号诱变获得的白穗突变体为研究材料，其表型为抽穗后穗部表现白色。为了克隆突变体中的白穗基因，我们构建了突变体和NJ11的F2分离群体。 通过对群体的白化性状调查，首先选取了10个白穗的F2单株，利用分布于水稻12条染色体上的SSR标记进行初步连锁。遗传分析发现控制该形状的基因位于水稻第3染色体上，和SSR标记I3-8呈共分离。这为该白穗基因的精细定位和功能研究奠定了基础。株高是与产量相关的重要农艺性状，株高超过一定范围容易引起倒伏而减产，矮秆不仅有利于抗倒伏，而且耐贫瘠，有利于提高产量。MutMap作为一种高通量的测序方法，有着高效率、低成本、能快速定位到基因的优点。本实验以一个矮秆突变体为材料，利用MutMap方法快速定位矮秆基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1 DNA的提取 3
1.2.2聚合酶链式反应4
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳5
1.2.4 MutMap测序文库构建5
1.2.5 MutMap测序及数据分析6
2结果与分析7
2.1白穗突变体的初定位7
2.2 MutMap文库构建和候选基因的挑选8
3讨论 10
3.1宁粳4号突变体表型的具体鉴定和定位10
3.2设计后续试验对宁粳4号白穗突变体进行精细定位10
3.3 MutMap快速定位矮杆基因10
致谢12
参考文献12
水稻白穗和矮秆基因的定位
金善宝实验班(植物生产类) 范磊
引言
引言 水稻（Oryza sativa）是世界上大多数人类的主粮，在中国、印度、日本和一些东南亚地区国家广泛种植[1]。它不仅是居民的主食，还可以作为牲畜饲料、酿酒原料和燃料，在许多国家都具有重要的农业地位。我国拥有悠久的种植水 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
稻的历史，并在水稻各方面的研究中都有杰出的成就，然而我国作为一个以稻米为主食的人口大国，对粮食产量的需求仍在不断增加。因此提高水稻产量，保证水稻高产稳产一直是水稻育种工作者所追求的目标。
水稻穗部距离籽粒较近，根据“源”“库”关系，小穗光合作用可能对水稻产量具有一定影响。叶绿体为光合作用的场所，是能量转换和物质积累的基本单位，质体从前体发育成具有光合活性的叶绿体是植物生长发育的重要代谢过程，该过程受核基因和质体基因共同调控。因质体基因的编码能力有限，核基因在调控质体发育过程中起主导作用，超过95% 的叶绿体蛋白由核基因编码合成[2]。在植物中，叶绿体主要在叶片中，植物基因的突变可能导致叶片白化。在单子叶植物中，叶片白化通常发生在叶片近脉附近，呈条纹状。电镜观察白化是因为基因突变影响了叶绿体发育过程，导致了质体发育失常[3]。但是，对于非叶片组织，由于突变体的缺乏，叶绿体发育的分子机制还不清晰。目前在水稻中仅鉴定到8个穗部白化突变体，根据穗部表型分为两类，一类为内外稃失绿白化，如wp1（white panicle 1）[4]、wslwp(white striped leaf and white panicle)[5]、wlp1(white leaf and panicles 1)[6]和stwp(stripe white leaf and white panicle)[7]；另一类内外稃和穗轴枝梗都呈白色，如wp（t）[8]、wp2（white panicle 2）[4]、stfon (streaked leaf and floral organ number)[9]和wp4（white panicle 4）[10]。
目前为止，基因克隆技术已经越来越多。本实验所采用的是图位克隆技术（mapbased cloning）。图位克隆是随着分子标记的不断开发、分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种基因克隆技术，成为分离和克隆基因的常规方法。根据连锁不平衡原理，与目的基因距离越近的染色体区段在染色体分离时发生重组交换的可能性越小，即与目的基因距离越近的分子标记也会与目的基因的连锁更紧密。染色体上分布着大量的分子标记，利用这些分子标记就可以初步确定目的基因在染色体上的大致位置，之后再通过染色体步移（chromosome walking）逐步逼近目的基因。筛选与目标基因连锁的分子标记(molecular markers)是实现基因图位克隆的关键，已有几十种技术可用于分子标记的筛选[11]。目前图位克隆已经应用于水稻、拟南芥等作物研究中[12、13]。
株高是与产量相关的重要农艺性状，株高超过一定范围容易引起倒伏而减产，矮秆不仅有利于抗倒伏，而且耐贫瘠，有利于提高产量。随着水稻半矮秆基因sdl(semidwarf)的发现与应用，自20世纪60年代起，在全世界范围内掀起了一场水稻育种的“绿色革命”[14]。水稻株高分为高秆、半矮秆和矮秆3种类型，其中半矮秆具有重要的育种价值。根据表型可以将矮源分为4类：小粒矮秆、多蘖矮秆，半矮秆和畸形矮秆[15]。水稻矮秆株型的原因有两种，节间长度缩短和节间数减少。而节间长度缩短又分为某一节间缩短和所有节间缩短。矮秆突变体根据节间长度的变化可以分为5类：dn型、d6型、dm型、sh型和nl型。dn型各节间的比例和野生型相似，各节间按相同比例减少。dm型只有倒2节间缩短。d6型仅有最上部节间正常伸长，其它节间均缩短。sh型只有最上面节间不伸长。而nl型为倒1节间缩短，倒4节间伸长[16]。造成的水稻矮秆的生理机制主要有两种，第一种为细胞长度变短，第二种与水稻植株内生长素（IAA）、赤霉素（GA）和独脚金内酯（SL）、油菜素内酯（BR）、脱落酸(ABA)和乙烯等植物激素的表达水平相关[17]。水稻矮杆基因分为两类，一类是单基因控制的质量性状，另一类是多基因控制的数量性状。大多数水稻株高由13对隐性主基因控制，受微效基因控制。而且矮秆突变体多由一对隐性基因控制。由于理想株型能提高光能和营养元素的利用率，提高经济系数和生物产量，培育理想株型的品种已经成为了育种家们的新目标。而株高作为理想株型的主要构成部分之一，寻找可利用的矮杆基因已成重中之重。目前已经克隆的矮杆基因除了sd1还有很多，比如第5条染色体编码GTP结合蛋白α亚基的d1[18]，第1条染色体上编码细胞色素P450蛋白的d2[19]等。
随着各水稻基因组测序的完成, MutMap 克隆基因方法应运而生，该方法结合高通量的二代测序方法, 充分利用水稻重测序的数据及分析优势, 通过把突变体群体重测序结果与组装的野生型基因组序列相比对, 找出水稻突变体基因。将确定表型的突变体和和对应的用于突变的野生型杂交，F1经自交授粉得到F2分离群体，在F2中挑选突变体表型的极端个体。因为F2是突变体和对应野生型亲本杂交产生，所以与表型相关的分离位点相对较少。在大多数情况下，即使突变的表型差异非常小，分离出的表型也能轻松地找到。突变体由诱变剂诱变产生的核苷酸位点都可以检测为单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性（indels）。在F2代大多数的SNPs都会以1：1的比例分离，但是，与表型连锁的位点在拥有突变表型的极端个体中是纯合的。如果提取F2代的隐性极端表型个体的DNA，并进行10倍以上的基因组覆盖率的测序，在和表型无关的SNP位点预计应该有50%野生型的reads和50%的突变体类型的reads。但是与表型连锁的SNP位点和导致突变的位点应该出现大于50%突变体类型的reads和小于50%野生型的reads。如果定义SNP index为突变体类型的SNP和该SNP位点总的reads的比，那么在和表型无关的位点SNP index应该等于0.5，在和因果位点连锁的位点SNP index应该在0.5和1之间，在导致突变的位点SNP index应该等于1。DNA位点分离的规律遵循二项式分布，因此检测到假阳性位点的概率是可以计算的。在一个与表型无关的SNP位点检测到SNP的概率为0.5，如果样本大小（该位点的测序深度）为10，SNP index=1的概率为(0.5)10=(10)3,因此连续4个位点SNP index等于1的概率应该小于等于2.3×109。MutMap大大降低了基因克隆成本, 缩短了基因克隆时间。MutMap比较的是突变体和对应的野生型，因此只需要相对较少的SNP标记来寻找与相应表型关联的突变位点,只要该区域有足够的序列覆盖度，就可以找到与相应表型关联的SNP, 发现诱变材料中微小的突变[20、21]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1 DNA的提取 3
1.2.2聚合酶链式反应4
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳5
1.2.4 MutMap测序文库构建5
1.2.5 MutMap测序及数据分析6
2结果与分析7
2.1白穗突变体的初定位7
2.2 MutMap文库构建和候选基因的挑选8
3讨论 10
3.1宁粳4号突变体表型的具体鉴定和定位10
3.2设计后续试验对宁粳4号白穗突变体进行精细定位10
3.3 MutMap快速定位矮杆基因10
致谢12
参考文献12
水稻白穗和矮秆基因的定位
金善宝实验班(植物生产类) 范磊
引言
引言 水稻（Oryza sativa）是世界上大多数人类的主粮，在中国、印度、日本和一些东南亚地区国家广泛种植[1]。它不仅是居民的主食，还可以作为牲畜饲料、酿酒原料和燃料，在许多国家都具有重要的农业地位。我国拥有悠久的种植水 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
稻的历史，并在水稻各方面的研究中都有杰出的成就，然而我国作为一个以稻米为主食的人口大国，对粮食产量的需求仍在不断增加。因此提高水稻产量，保证水稻高产稳产一直是水稻育种工作者所追求的目标。
水稻穗部距离籽粒较近，根据“源”“库”关系，小穗光合作用可能对水稻产量具有一定影响。叶绿体为光合作用的场所，是能量转换和物质积累的基本单位，质体从前体发育成具有光合活性的叶绿体是植物生长发育的重要代谢过程，该过程受核基因和质体基因共同调控。因质体基因的编码能力有限，核基因在调控质体发育过程中起主导作用，超过95% 的叶绿体蛋白由核基因编码合成[2]。在植物中，叶绿体主要在叶片中，植物基因的突变可能导致叶片白化。在单子叶植物中，叶片白化通常发生在叶片近脉附近，呈条纹状。电镜观察白化是因为基因突变影响了叶绿体发育过程，导致了质体发育失常[3]。但是，对于非叶片组织，由于突变体的缺乏，叶绿体发育的分子机制还不清晰。目前在水稻中仅鉴定到8个穗部白化突变体，根据穗部表型分为两类，一类为内外稃失绿白化，如wp1（white panicle 1）[4]、wslwp(white striped leaf and white panicle)[5]、wlp1(white leaf and panicles 1)[6]和stwp(stripe white leaf and white panicle)[7]；另一类内外稃和穗轴枝梗都呈白色，如wp（t）[8]、wp2（white panicle 2）[4]、stfon (streaked leaf and floral organ number)[9]和wp4（white panicle 4）[10]。
目前为止，基因克隆技术已经越来越多。本实验所采用的是图位克隆技术（mapbased cloning）。图位克隆是随着分子标记的不断开发、分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种基因克隆技术，成为分离和克隆基因的常规方法。根据连锁不平衡原理，与目的基因距离越近的染色体区段在染色体分离时发生重组交换的可能性越小，即与目的基因距离越近的分子标记也会与目的基因的连锁更紧密。染色体上分布着大量的分子标记，利用这些分子标记就可以初步确定目的基因在染色体上的大致位置，之后再通过染色体步移（chromosome walking）逐步逼近目的基因。筛选与目标基因连锁的分子标记(molecular markers)是实现基因图位克隆的关键，已有几十种技术可用于分子标记的筛选[11]。目前图位克隆已经应用于水稻、拟南芥等作物研究中[12、13]。
株高是与产量相关的重要农艺性状，株高超过一定范围容易引起倒伏而减产，矮秆不仅有利于抗倒伏，而且耐贫瘠，有利于提高产量。随着水稻半矮秆基因sdl(semidwarf)的发现与应用，自20世纪60年代起，在全世界范围内掀起了一场水稻育种的“绿色革命”[14]。水稻株高分为高秆、半矮秆和矮秆3种类型，其中半矮秆具有重要的育种价值。根据表型可以将矮源分为4类：小粒矮秆、多蘖矮秆，半矮秆和畸形矮秆[15]。水稻矮秆株型的原因有两种，节间长度缩短和节间数减少。而节间长度缩短又分为某一节间缩短和所有节间缩短。矮秆突变体根据节间长度的变化可以分为5类：dn型、d6型、dm型、sh型和nl型。dn型各节间的比例和野生型相似，各节间按相同比例减少。dm型只有倒2节间缩短。d6型仅有最上部节间正常伸长，其它节间均缩短。sh型只有最上面节间不伸长。而nl型为倒1节间缩短，倒4节间伸长[16]。造成的水稻矮秆的生理机制主要有两种，第一种为细胞长度变短，第二种与水稻植株内生长素（IAA）、赤霉素（GA）和独脚金内酯（SL）、油菜素内酯（BR）、脱落酸(ABA)和乙烯等植物激素的表达水平相关[17]。水稻矮杆基因分为两类，一类是单基因控制的质量性状，另一类是多基因控制的数量性状。大多数水稻株高由13对隐性主基因控制，受微效基因控制。而且矮秆突变体多由一对隐性基因控制。由于理想株型能提高光能和营养元素的利用率，提高经济系数和生物产量，培育理想株型的品种已经成为了育种家们的新目标。而株高作为理想株型的主要构成部分之一，寻找可利用的矮杆基因已成重中之重。目前已经克隆的矮杆基因除了sd1还有很多，比如第5条染色体编码GTP结合蛋白α亚基的d1[18]，第1条染色体上编码细胞色素P450蛋白的d2[19]等。
随着各水稻基因组测序的完成, MutMap 克隆基因方法应运而生，该方法结合高通量的二代测序方法, 充分利用水稻重测序的数据及分析优势, 通过把突变体群体重测序结果与组装的野生型基因组序列相比对, 找出水稻突变体基因。将确定表型的突变体和和对应的用于突变的野生型杂交，F1经自交授粉得到F2分离群体，在F2中挑选突变体表型的极端个体。因为F2是突变体和对应野生型亲本杂交产生，所以与表型相关的分离位点相对较少。在大多数情况下，即使突变的表型差异非常小，分离出的表型也能轻松地找到。突变体由诱变剂诱变产生的核苷酸位点都可以检测为单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性（indels）。在F2代大多数的SNPs都会以1：1的比例分离，但是，与表型连锁的位点在拥有突变表型的极端个体中是纯合的。如果提取F2代的隐性极端表型个体的DNA，并进行10倍以上的基因组覆盖率的测序，在和表型无关的SNP位点预计应该有50%野生型的reads和50%的突变体类型的reads。但是与表型连锁的SNP位点和导致突变的位点应该出现大于50%突变体类型的reads和小于50%野生型的reads。如果定义SNP index为突变体类型的SNP和该SNP位点总的reads的比，那么在和表型无关的位点SNP index应该等于0.5，在和因果位点连锁的位点SNP index应该在0.5和1之间，在导致突变的位点SNP index应该等于1。DNA位点分离的规律遵循二项式分布，因此检测到假阳性位点的概率是可以计算的。在一个与表型无关的SNP位点检测到SNP的概率为0.5，如果样本大小（该位点的测序深度）为10，SNP index=1的概率为(0.5)10=(10)3,因此连续4个位点SNP index等于1的概率应该小于等于2.3×109。MutMap大大降低了基因克隆成本, 缩短了基因克隆时间。MutMap比较的是突变体和对应的野生型，因此只需要相对较少的SNP标记来寻找与相应表型关联的突变位点,只要该区域有足够的序列覆盖度，就可以找到与相应表型关联的SNP, 发现诱变材料中微小的突变[20、21]。
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