hpa1蛋白对番茄上蚜虫的韧皮部抗性
Hpa1是水稻黄单胞菌产生的一种harpin蛋白质，有诱导植物抗病抗虫的效应，尤其是抗蚜虫。而随着温室番茄的种植面积不断增大，温室中桃蚜为害番茄时有发生，因此本课题对Hpa1蛋白能否帮助番茄提高抵抗桃蚜能力进行了研究。将提取成功的Hpa1蛋白溶液均匀喷洒到番茄植物叶片上后，番茄的抗桃蚜能力有所提高，具体表现在番茄上桃蚜的逃逸数量增多，叶片中胼胝质沉积增多，桃蚜取食番茄时间减少等。进而体现出番茄叶片韧皮部的防卫反应有所增强，对桃蚜的诱导抗虫能力增强。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1植物材料及其生长条件3
1.2桃蚜的饲养3
1.3 Hpa1蛋白的提取及检测3
1.3.1 制样3
1.3.2 电泳检测4
1.3.3过敏反应检测4
1.4桃蚜趋避活动的监测5
1.5桃蚜取食活动的监测5
1.6胼胝质的化学发光实验5
1.7数据分析5
2结果与分析5
2.1对照组和Hpa1处理组番茄接种桃蚜后24h内逃逸情况比较5
2.2桃蚜在对照组和Hpa1处理组番茄上的刺吸取食波形比较6
2.3胼胝质染色鉴定结果6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
Hpa1蛋白对番茄上蚜虫的韧皮部抗性
引言
近年来，食品安全问题广泛受到人们的热切关注，由此，有机蔬菜产业取得了蓬勃的发展空间，其中集高投入、高产出与高新技术为一体的日光温室蔬菜已成为农业集约化生产的重要产业，成为推动农业经济发展，促进农业科技提升，增添农民经济水平的重要途径。同时，良好的生长环境也为病虫害的发生和流行提供了侵染源和寄宿场所，加重其为害程度(王宇菲 2007)。
桃蚜（Myzus persicae，又名烟蚜）作为蚜虫中最重要的一个种，广泛分布于世界各地，能够危害的植物已超过50个科400个种(Weber G 1985)，对十字花科蔬菜、茄科蔬菜和果树等均可产生直接或间接的不良影响， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
据统计，温室中几乎所有的栽培植物都可受到其为害，是著名的温室蚜虫，并且桃蚜还可以传播至少115种植物病毒病(杨效文等 1998)，是常见的多发害虫。
番茄作为一直以来备受人们喜爱的蔬菜，是日光温室蔬菜中被广泛种植的蔬菜之一，为防止桃蚜对其为害，曾采用农药防治的方法进行治理，如使用25%的溴氰菊酯3000mg/ kg 进行药剂喷雾等(朱广梅 2008)。但农药防治的方法在农业中注定被日益发展的生物防治科技所取代，根据前人的研究发现，从革兰氏阴性植物病原细菌中产生的Harpins蛋白对诱发植物过敏反应(杨军等 2005)，诱导植物抗虫抗病，促进作物生长具有一定的作用，其中韧皮部的相关防卫反应在防御蚜虫等刺吸式昆虫的取食中具有重要作用。本次实验利用前人获得的激发子Hpa1和合作903大红番茄为材料，探讨Hpa1蛋白对番茄上桃蚜种群的影响以及相关的韧皮部防卫反应作用。
桃蚜为害番茄的叶片，以刺吸方式在植株上取食汁液，导致叶片卷曲变黄，影响番茄的正常生长发育，还可以传播病毒病，造成番茄病毒病，导致花叶、蕨叶、条纹、丛生、卷叶和黄顶现象。由于桃蚜是刺吸式昆虫，以口针刺入番茄叶片韧皮部取食，因此番茄的韧皮部防卫反应对抵抗桃蚜侵袭有着重要意义。
Hpa1（即HpaG）是由水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae）产生的一类harpin蛋白，前人研究发现，Harpins蛋白对诱发植物过敏反应(刘爱新等 2005)，诱导植物抗虫抗病(Staskawicz B J 2001；闻伟刚等 2003)，促进作物生长具有一定的作用(姚桢 2004；任秀艳 2007)，其中韧皮部的相关防卫反应在防御蚜虫等刺吸式昆虫的取食中具有重要作用。通过对番茄进行Hpa1蛋白的喷雾处理，监测处理后桃蚜在番茄上的取食情况和取食后番茄叶片韧皮部胼胝质的沉积情况，实验证明了Hpa1蛋白可以增强番茄对桃蚜的抗虫性。
1 材料与方法
1．1 植物材料及其生长条件
实验采用南京农科院旁种子批发店铺所购买的合作903大红番茄品种。种植前适当催芽处理：在培养皿中垫23层滤纸，加水湿润后均匀地排列番茄种子3040颗，后置于28 oC烘箱或30oC以上的室内中，保持湿润的环境，并给予一定的光照条件。催芽至种子出根出芽，将其种植于容积为15L的盆钵中，盆中土壤取自大学温室，经试验最终选用蛭石，效果最佳。将种植好的幼苗置于网罩内进行养护，以防虫害侵袭，灌溉用水取自来水即可。温室控制条件为12h光照12h黑暗处理一循环，温度为23.4oC，湿度为56.5%。种植在温室中的番茄60d后即可陆续用于不同的实验研究（徐刚等 2005）。
用于做蛋白过敏反应的烟草品种为珊西烟，在播种培育至出苗时再移栽至每盆一株，土壤选用蛭石，灌溉水中加适量花无缺（肥料），生长至56叶期使用（刘爱新等 2005），与番茄于同一温室中种植。
1. 2 桃蚜的饲养
桃蚜采集于大学拟南芥培养室种植的盆栽拟南芥中(张春玲等 2012)，培育温度为22oC，湿度为51.5%。将采集的桃蚜转移至番茄叶片上进行养殖，未能得到适合实验用的非初代桃蚜，因此选用拟南芥上的成蚜直接进行实验。实验时用毛笔将拟南芥上的无翅桃蚜转移至番茄叶片上。
3 Hpa1蛋白的提取及检测
1．3．1 制样
挑取大肠杆菌BL21菌株pET30：hpa1于20ml LB液体培养基中，加入20μl KN抗生素（比例1:1000），37oC摇床245r/min培养，过夜活化（912h），做2组处理，标号Hpa11，Hpa12。
以1:50比例，将活化的过夜培养物加入到50ml LB液体培养基中（1ml过夜培养菌液），加入50μl KN抗生素（比例1:1000），37oC摇床245r/min扩大培养12h，每组过夜培养菌液做4瓶处理，共8瓶，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液的OD600在0.60.8之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态（不同基因对菌体的影响不同，因此需要通过实验确定菌液浓度达到标准值的时间，经多次实验，一般1h时菌液浓度达到标准）。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1植物材料及其生长条件3
1.2桃蚜的饲养3
1.3 Hpa1蛋白的提取及检测3
1.3.1 制样3
1.3.2 电泳检测4
1.3.3过敏反应检测4
1.4桃蚜趋避活动的监测5
1.5桃蚜取食活动的监测5
1.6胼胝质的化学发光实验5
1.7数据分析5
2结果与分析5
2.1对照组和Hpa1处理组番茄接种桃蚜后24h内逃逸情况比较5
2.2桃蚜在对照组和Hpa1处理组番茄上的刺吸取食波形比较6
2.3胼胝质染色鉴定结果6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
Hpa1蛋白对番茄上蚜虫的韧皮部抗性
引言
近年来，食品安全问题广泛受到人们的热切关注，由此，有机蔬菜产业取得了蓬勃的发展空间，其中集高投入、高产出与高新技术为一体的日光温室蔬菜已成为农业集约化生产的重要产业，成为推动农业经济发展，促进农业科技提升，增添农民经济水平的重要途径。同时，良好的生长环境也为病虫害的发生和流行提供了侵染源和寄宿场所，加重其为害程度(王宇菲 2007)。
桃蚜（Myzus persicae，又名烟蚜）作为蚜虫中最重要的一个种，广泛分布于世界各地，能够危害的植物已超过50个科400个种(Weber G 1985)，对十字花科蔬菜、茄科蔬菜和果树等均可产生直接或间接的不良影响， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
据统计，温室中几乎所有的栽培植物都可受到其为害，是著名的温室蚜虫，并且桃蚜还可以传播至少115种植物病毒病(杨效文等 1998)，是常见的多发害虫。
番茄作为一直以来备受人们喜爱的蔬菜，是日光温室蔬菜中被广泛种植的蔬菜之一，为防止桃蚜对其为害，曾采用农药防治的方法进行治理，如使用25%的溴氰菊酯3000mg/ kg 进行药剂喷雾等(朱广梅 2008)。但农药防治的方法在农业中注定被日益发展的生物防治科技所取代，根据前人的研究发现，从革兰氏阴性植物病原细菌中产生的Harpins蛋白对诱发植物过敏反应(杨军等 2005)，诱导植物抗虫抗病，促进作物生长具有一定的作用，其中韧皮部的相关防卫反应在防御蚜虫等刺吸式昆虫的取食中具有重要作用。本次实验利用前人获得的激发子Hpa1和合作903大红番茄为材料，探讨Hpa1蛋白对番茄上桃蚜种群的影响以及相关的韧皮部防卫反应作用。
桃蚜为害番茄的叶片，以刺吸方式在植株上取食汁液，导致叶片卷曲变黄，影响番茄的正常生长发育，还可以传播病毒病，造成番茄病毒病，导致花叶、蕨叶、条纹、丛生、卷叶和黄顶现象。由于桃蚜是刺吸式昆虫，以口针刺入番茄叶片韧皮部取食，因此番茄的韧皮部防卫反应对抵抗桃蚜侵袭有着重要意义。
Hpa1（即HpaG）是由水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae）产生的一类harpin蛋白，前人研究发现，Harpins蛋白对诱发植物过敏反应(刘爱新等 2005)，诱导植物抗虫抗病(Staskawicz B J 2001；闻伟刚等 2003)，促进作物生长具有一定的作用(姚桢 2004；任秀艳 2007)，其中韧皮部的相关防卫反应在防御蚜虫等刺吸式昆虫的取食中具有重要作用。通过对番茄进行Hpa1蛋白的喷雾处理，监测处理后桃蚜在番茄上的取食情况和取食后番茄叶片韧皮部胼胝质的沉积情况，实验证明了Hpa1蛋白可以增强番茄对桃蚜的抗虫性。
1 材料与方法
1．1 植物材料及其生长条件
实验采用南京农科院旁种子批发店铺所购买的合作903大红番茄品种。种植前适当催芽处理：在培养皿中垫23层滤纸，加水湿润后均匀地排列番茄种子3040颗，后置于28 oC烘箱或30oC以上的室内中，保持湿润的环境，并给予一定的光照条件。催芽至种子出根出芽，将其种植于容积为15L的盆钵中，盆中土壤取自大学温室，经试验最终选用蛭石，效果最佳。将种植好的幼苗置于网罩内进行养护，以防虫害侵袭，灌溉用水取自来水即可。温室控制条件为12h光照12h黑暗处理一循环，温度为23.4oC，湿度为56.5%。种植在温室中的番茄60d后即可陆续用于不同的实验研究（徐刚等 2005）。
用于做蛋白过敏反应的烟草品种为珊西烟，在播种培育至出苗时再移栽至每盆一株，土壤选用蛭石，灌溉水中加适量花无缺（肥料），生长至56叶期使用（刘爱新等 2005），与番茄于同一温室中种植。
1. 2 桃蚜的饲养
桃蚜采集于大学拟南芥培养室种植的盆栽拟南芥中(张春玲等 2012)，培育温度为22oC，湿度为51.5%。将采集的桃蚜转移至番茄叶片上进行养殖，未能得到适合实验用的非初代桃蚜，因此选用拟南芥上的成蚜直接进行实验。实验时用毛笔将拟南芥上的无翅桃蚜转移至番茄叶片上。
3 Hpa1蛋白的提取及检测
1．3．1 制样
挑取大肠杆菌BL21菌株pET30：hpa1于20ml LB液体培养基中，加入20μl KN抗生素（比例1:1000），37oC摇床245r/min培养，过夜活化（912h），做2组处理，标号Hpa11，Hpa12。
以1:50比例，将活化的过夜培养物加入到50ml LB液体培养基中（1ml过夜培养菌液），加入50μl KN抗生素（比例1:1000），37oC摇床245r/min扩大培养12h，每组过夜培养菌液做4瓶处理，共8瓶，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液的OD600在0.60.8之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态（不同基因对菌体的影响不同，因此需要通过实验确定菌液浓度达到标准值的时间，经多次实验，一般1h时菌液浓度达到标准）。
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