氯噻啉荧光偏振免疫分析方法研究
摘要：本研究成功建立了基于多克隆抗体的氯噻啉均相荧光偏振免疫分析方法（FPIA），并且应用于农产品和环境样品中氯噻啉残留的高通量快速检测。通过将氯噻啉半抗原和荧光素偶联合成两种不同间隔臂的荧光标记氯噻啉示踪物，对荧光示踪物结构对FPIA的影响进行研究。在最佳优化条件下，氯噻啉检测的抑制中浓度（IC50）和最低检测浓度（LOD，IC10）分别为260.00和0.46ng/mL。在番茄、梨、大米、苹果、白菜、黄瓜和水中的平均添加回收率在95.87-103.97%之间，相对标准偏差在5.43-12.04%之间。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
实验材料与方法3
1.1实验材料3
1.1.1主要试剂3
1.1.2主要仪器3
1.1.3 缓冲溶液3
1.2 实验方法3
1.2.1 荧光示踪物的合成3
1.2.2 FPIA操作程序4
1.2.3 条件优化5
1.2.4标准曲线建立和基质效应测定5
1.2.5 添加回收率测定 5
1.2.6 实际样品分析 5
2 结果与分析 5
2．1荧光示踪物鉴定5
2.1.1 荧光示踪物和抗体稀释倍数6
2.1.2 示踪物和抗体结合动力6
2.2 FPIA法工作缓冲液条件优化6
2.2.1 甲醇含量6
2.2.2 Na+浓度7
2.2.3 pH值7
2.3灵敏度 7
2.4基质效应8
2.5添加回收率9
3 结论与讨论 10
致谢11
参考文献11 氯噻啉荧光偏振免疫分析方法研究
引言
引言
农药在环境和食品中的残留，不仅对人类健康造成了长期的潜在危害，而且对我国农产品的出口产生了巨大的冲击。现代社会人们对于环境的要求越来越高，对高效低毒的绿色农药的需求也越来越迫切。新烟碱类杀虫剂是继有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
类杀虫剂之后的第四代杀虫剂。由于其具有低毒靶标独特、应用方法多样等特点，使得它们成为农业生产中具有广泛用途的一类杀虫剂。氯噻啉是新烟碱类杀虫剂中的重要品种。
氯噻啉是江苏省南通市江山农药化工股份有限公司自行研制开发的一种新烟碱类杀虫剂，作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体的新烟碱类内吸性杀虫剂，可用于防治吮吸式口器害虫，如蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马、粉虱及其抗性品系，同时对鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫也有防效，尤其对水稻二化螟、三化螟的毒力比其他烟碱类杀虫剂高，广泛应用于水稻、小麦、蔬菜、烟草、果树、茶树等作物上，具有高效、光谱、低毒等优点。作为高毒农药的代替品种，氯噻啉的使用量日益上升，且随着人们对食品安全关注程度的增强，对其在农产品和环境中残留检测方法的研究也已广泛开展[1,2]。
目前，对氯噻啉残留的检测主要依赖高效液相色谱法( HPLC)。贺敏等[3]建立了水稻中氯噻啉残留的分析方法，在稻田水、茎叶、稻壳和土壤中的最低检测浓度分别为 0.0004、0.01、0.02和0.005mg/kg; 张丽芬[4]建立了甘蓝中氯噻啉残留的分析方法,其最低检测浓为3.2 mg/kg。由于常规仪器分析方法难以满足大批量样品的检测，因此开发高效、快速、灵敏的检测方法显得十分必要。农药残留的快速检测方法有很多，其中免疫学技术在农药残留检测中的发展较快，应用也逐渐广泛起来。它具有灵敏、快速、特异性强、分析容量大、安全可靠等优点，非常适宜于复杂基质中痕量组分的分析和现场快速检测。李明等[5]建立了量子点荧光免疫分析方法同时检测环境和农业中的噻虫胺和噻虫啉，第一次使用量子点荧光免疫的方法同时检测环境中的两种农药。荧光偏振免疫分析是免疫分析技术的一种，该技术是将高灵敏的发光检测与高特异性的免疫反应相结合，用于检测各种抗原、半抗原、抗体、酶和药物等的分析技术。是继放射免疫分析、酶联免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。其检测灵敏度高，线性范围宽，分析方法简便快捷，仪器简单实用。其中Jolley 等[6]第一次应用 FPIA 方法检测人血清中的氨基糖甙类抗生素，可以认为是 FPIA 方法在药物检测中应用的开端。上世纪80年代，Abbott公司开发出一种 Abbott TDx自动荧光偏振测量系统，并实现了商品化，用于血液中治疗性药物的检测。Lukens等[7]在1977年检测了农药苯菌灵(Benomyl)的主要代谢物2氨基苯并咪唑。Colbert [8]第一次用 FPIA 进行农药残留检测，他们建立了一种在血液中检测百草枯的方法。近年来，国外有关应用于临床检验、毒品分析、农药残留量分析、环境和食品监测等方面的 FPIA方法的报道逐年增加，各种方法相继建立并已逐步推广应用。但目前未见荧光偏振免疫分析在农药残留检测中应用的报道。本研究首次制备了氯噻啉半抗原和多克隆抗体，建立了快速灵敏的氯噻啉残留PFIA检测分析方法。
常见的传统免疫分析方法，如酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法等，已经在快速、高灵敏、高特异性、高通量检测中显示出显著的优势。然而，这些方法均为非均相分析方法，检测过程需要繁杂的固相包被、分离、洗涤、温育、显色等程序，依旧需要耗费较长时间，通常大于2小时 [9]。将非均相免疫反应模式（需要分离 步骤）改变为均相免疫反应模式（无需分离步骤）是使检测更为简单快速化的理想方法。作为一种均相反应模式，荧光偏振免疫分析方法（FPIA）以其操作非常简便、检测速度非常快、无需长时间温育洗涤等过程的优势，已经在环境和食品安全有害物质筛选检测方面得到了重点关注[10]。FPIA是一种在单一反应体系中进行的小分子检测物和荧光标记抗原示踪物竞争结合抗体结合位点的免疫分析方法[11]，通过检测免疫结合完成前后引起荧光探针荧光偏振值（FP）变化，进而达到定量目的，FP值与待检测物浓度成反比。当没有分析物时，荧光示踪物和抗体特异性结合形成高分子复合物，旋转速度会变慢，产生高FP值；相反，当体系中加入分析物时，抗体的结合位点会被分析物结合，荧光示踪物会游离在体系中旋转速度很快，FP值较低[9]。由于FPIA法具有快速、简便的优势使得分析检测可以在短时间内通过一步法实现。近年来，FPIA法已经在医药、食品和环境中多种污染物检测中得到广泛研究和应用[12~14]。
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摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
实验材料与方法3
1.1实验材料3
1.1.1主要试剂3
1.1.2主要仪器3
1.1.3 缓冲溶液3
1.2 实验方法3
1.2.1 荧光示踪物的合成3
1.2.2 FPIA操作程序4
1.2.3 条件优化5
1.2.4标准曲线建立和基质效应测定5
1.2.5 添加回收率测定 5
1.2.6 实际样品分析 5
2 结果与分析 5
2．1荧光示踪物鉴定5
2.1.1 荧光示踪物和抗体稀释倍数6
2.1.2 示踪物和抗体结合动力6
2.2 FPIA法工作缓冲液条件优化6
2.2.1 甲醇含量6
2.2.2 Na+浓度7
2.2.3 pH值7
2.3灵敏度 7
2.4基质效应8
2.5添加回收率9
3 结论与讨论 10
致谢11
参考文献11 氯噻啉荧光偏振免疫分析方法研究
引言
引言
农药在环境和食品中的残留，不仅对人类健康造成了长期的潜在危害，而且对我国农产品的出口产生了巨大的冲击。现代社会人们对于环境的要求越来越高，对高效低毒的绿色农药的需求也越来越迫切。新烟碱类杀虫剂是继有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
类杀虫剂之后的第四代杀虫剂。由于其具有低毒靶标独特、应用方法多样等特点，使得它们成为农业生产中具有广泛用途的一类杀虫剂。氯噻啉是新烟碱类杀虫剂中的重要品种。
氯噻啉是江苏省南通市江山农药化工股份有限公司自行研制开发的一种新烟碱类杀虫剂，作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体的新烟碱类内吸性杀虫剂，可用于防治吮吸式口器害虫，如蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马、粉虱及其抗性品系，同时对鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫也有防效，尤其对水稻二化螟、三化螟的毒力比其他烟碱类杀虫剂高，广泛应用于水稻、小麦、蔬菜、烟草、果树、茶树等作物上，具有高效、光谱、低毒等优点。作为高毒农药的代替品种，氯噻啉的使用量日益上升，且随着人们对食品安全关注程度的增强，对其在农产品和环境中残留检测方法的研究也已广泛开展[1,2]。
目前，对氯噻啉残留的检测主要依赖高效液相色谱法( HPLC)。贺敏等[3]建立了水稻中氯噻啉残留的分析方法，在稻田水、茎叶、稻壳和土壤中的最低检测浓度分别为 0.0004、0.01、0.02和0.005mg/kg; 张丽芬[4]建立了甘蓝中氯噻啉残留的分析方法,其最低检测浓为3.2 mg/kg。由于常规仪器分析方法难以满足大批量样品的检测，因此开发高效、快速、灵敏的检测方法显得十分必要。农药残留的快速检测方法有很多，其中免疫学技术在农药残留检测中的发展较快，应用也逐渐广泛起来。它具有灵敏、快速、特异性强、分析容量大、安全可靠等优点，非常适宜于复杂基质中痕量组分的分析和现场快速检测。李明等[5]建立了量子点荧光免疫分析方法同时检测环境和农业中的噻虫胺和噻虫啉，第一次使用量子点荧光免疫的方法同时检测环境中的两种农药。荧光偏振免疫分析是免疫分析技术的一种，该技术是将高灵敏的发光检测与高特异性的免疫反应相结合，用于检测各种抗原、半抗原、抗体、酶和药物等的分析技术。是继放射免疫分析、酶联免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。其检测灵敏度高，线性范围宽，分析方法简便快捷，仪器简单实用。其中Jolley 等[6]第一次应用 FPIA 方法检测人血清中的氨基糖甙类抗生素，可以认为是 FPIA 方法在药物检测中应用的开端。上世纪80年代，Abbott公司开发出一种 Abbott TDx自动荧光偏振测量系统，并实现了商品化，用于血液中治疗性药物的检测。Lukens等[7]在1977年检测了农药苯菌灵(Benomyl)的主要代谢物2氨基苯并咪唑。Colbert [8]第一次用 FPIA 进行农药残留检测，他们建立了一种在血液中检测百草枯的方法。近年来，国外有关应用于临床检验、毒品分析、农药残留量分析、环境和食品监测等方面的 FPIA方法的报道逐年增加，各种方法相继建立并已逐步推广应用。但目前未见荧光偏振免疫分析在农药残留检测中应用的报道。本研究首次制备了氯噻啉半抗原和多克隆抗体，建立了快速灵敏的氯噻啉残留PFIA检测分析方法。
常见的传统免疫分析方法，如酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法等，已经在快速、高灵敏、高特异性、高通量检测中显示出显著的优势。然而，这些方法均为非均相分析方法，检测过程需要繁杂的固相包被、分离、洗涤、温育、显色等程序，依旧需要耗费较长时间，通常大于2小时 [9]。将非均相免疫反应模式（需要分离 步骤）改变为均相免疫反应模式（无需分离步骤）是使检测更为简单快速化的理想方法。作为一种均相反应模式，荧光偏振免疫分析方法（FPIA）以其操作非常简便、检测速度非常快、无需长时间温育洗涤等过程的优势，已经在环境和食品安全有害物质筛选检测方面得到了重点关注[10]。FPIA是一种在单一反应体系中进行的小分子检测物和荧光标记抗原示踪物竞争结合抗体结合位点的免疫分析方法[11]，通过检测免疫结合完成前后引起荧光探针荧光偏振值（FP）变化，进而达到定量目的，FP值与待检测物浓度成反比。当没有分析物时，荧光示踪物和抗体特异性结合形成高分子复合物，旋转速度会变慢，产生高FP值；相反，当体系中加入分析物时，抗体的结合位点会被分析物结合，荧光示踪物会游离在体系中旋转速度很快，FP值较低[9]。由于FPIA法具有快速、简便的优势使得分析检测可以在短时间内通过一步法实现。近年来，FPIA法已经在医药、食品和环境中多种污染物检测中得到广泛研究和应用[12~14]。
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