棉花黄萎病抗性鉴定方法的研究
棉花黄萎病是危害棉花最严重的病害之一，选育抗病品种是解决其最经济有效的途径，而抗性鉴定是黄萎病抗性遗传研究和育种抗病材料筛选最关键的环节。目前广泛采用的蘸根接种法，建立在对棉花根系造成人为创伤后，使病原菌快速侵入维管束的基础之上，虽然发病迅速，但由于创伤程度难以控制，棉花发病不一致，易产生假抗性，影响鉴定结果的准确性；抗性鉴定需在黄萎病症状出现后才能进行，对病症出现前病原菌侵入、扩展进程缺乏了解。本研究首先获得了转绿色荧光蛋白（GFP）基因的大丽轮枝菌菌株Vd-gfp5；比较蘸根法和培养基定量接种法两种方法接种TM-1的发病过程，发现培养基定量接种法发病一致性、重复性都优于蘸根法，且耗时短，可应用于棉花苗期黄萎病发病过程研究和抗性快速鉴定。采用该方法，以Vd-gfp5为病原菌，分别接种耐病品种海岛棉7124和感病品种TM-1，发现海7124各部分的GFP荧光强度远低于TM-1，侵染6d后，TM-1下胚轴和子叶节维管束中均检测到GFP荧光，而海7124仅在根和根茎中检测到GFP荧光；海7124病指显著低于TM-1，说明海7124对大丽轮枝菌具有一定的抗入侵和较强的抗扩展能力。采用转GFP基因的大丽轮枝菌结合培养基定量接种方法可以准确鉴定棉花黄萎病发病过程及其抗性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1质粒和菌株3
1.1.2 植物材料4
1.2方法 4
1.2.1转基因大丽轮枝菌的获得和致病性4
1.2.2病原菌培养与孢子悬浮液的制备4
1.2.3蘸根接种法 4
1.2.4培养基定量接种法 4
1.2.3.3组织病理学切片及显微观察4
2结果与分析5
2.1转基因大丽轮枝菌的获得5
2.2转基因大丽轮枝菌的鉴定6
2.3蘸根法与培养基定量接种法的比较7
2.4培养基定量接种法的应用8
3讨论9
致谢10
参考文献10
棉花
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
黄萎病的抗性鉴定方法的研究
引言
引言
棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界范围内最重要的的经济作物之一，棉花纤维作为纺织业重要的原材料，对稳定国民经济有重要作用。黄萎病菌属于真菌的半知菌亚门淡色菌科轮枝菌属，属内有若干种，宿主范围很广，约600多种木本植物和草本植物都能受到黄萎病菌的侵染，包括番茄、辣椒、马铃薯、菊花、棉花、苜蓿、枫树等[1，2]。在棉花上造成危害的黄萎病菌主要是黑白轮枝菌（Verticillium alhoatrum Reinke & Berth.）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）[3]。被称为棉花“癌症”的棉花黄萎病是一种土传性维管束系统病害，主要通过棉花根部入侵，并进一步在棉花植株的维管束系统内定殖和扩展，引起棉花叶片失绿变黄，萎蔫脱落，严重时造成植株死亡，严重威胁棉花产量及纤维品质，是制约绵花稳产高产的主要因素[4]。
棉花黄萎病于1914年在美国弗吉尼亚州发现，目前己遍及美国、中国、印度、乌兹别克斯坦、巴西、澳大利亚、乌干达、南非等几十个国家。1935年在引进美国斯字4B棉种时传入我国，大量研究显示我国的棉花黄萎病病原菌属于大丽轮枝菌[5]。20世纪五六十年代棉花黄萎病在南北方棉区迅速蔓延，造成棉花大面积减产，纤维品质下降[6] .；到了90年代，“落叶型”黄萎病在各棉区普遍发生，造成了1993、1995和1996年连续3年的全国性大爆发；2012年强致病力的黄萎病菌株已在全国各产棉省广泛分布[4]。棉花黄萎病已成为阻滞我国棉花产量增加和品质提高的最重要的因素之一，对其的防治迫在眉睫。由于大丽轮枝菌的变异性强，在与寄主的协同进化过程中受环境变化、人为因素等多种因素的影响，常会产生生理分化，出现新的致病类型[7]，且国内的棉花生产多位小户型种植模式，品种更换频繁，同一田块中可能有多种不同生理型黄萎病菌，为棉花黄萎病的防止带来新的难题。因此棉花黄萎病的防治一直是棉花生产上的难题。
由于缺乏有效的化学防治方法，利用和选育抗病品种是防治棉花黄萎病这种土传病害的最经济有效的方法［8］。但由于陆地棉抗黄萎病资源缺乏、及田间抗病性鉴定结果受多种环境因素影响，传统育种方法选育抗黄萎病品种进展缓慢。随着植物抗病分子生物学和遗传学的发展，运用现代基因工程技术进行抗病分子育种的条件已趋于成熟，但仍需更加深入理解植物抗黄萎病的机制，找到调控机制中的关键因子，为棉花抗病分子育种提供候选基因［4］。抗病品种的利用选育以及抗病基因的鉴定有赖于能够实时、动态、准确观测和鉴定大丽轮枝菌侵染棉花的进程以及棉花感染程度和发病程度的实验方法。目前广为接受和应用的棉花黄萎病抗性的鉴定方法是营养钵蘸根接种鉴定法、针刺接种鉴定法或其他类似方法，这类伤根接种法通过认为制造伤害使病性快速侵入，然后通过评估棉花幼苗的发病程度实现快速鉴定。但由于伤根程度很难做到标准化，因此，单株鉴定结果一致性和准确性较差，另外，依赖发病程度很难鉴定发病症状出现之前棉花对大丽轮枝菌的抗侵入和抗扩展的能力。因此，寻找一种快速而准确的抗病鉴定方法是棉花黄萎病理论研究和抗性育种的关键步骤。
近年发展起来的绿色荧光蛋白（GFP）标记系统和荧光显微技术是研究寄主植物与病原菌互作的重要方法。绿色荧光蛋白（GFP)是由Shimomura等在1962年从水母中分离纯化的一种在蓝光或紫外光激发下产生绿色荧光的蛋白质。由于GFP的编码序列仅约717bp，转化效率较高，在不同种属细胞中各个部位均能组成型表达，并在大量表达情况下对细胞正常生长及功能没有毒性，可直接在荧光显微镜或紫外光下可检测，是目前DNA重组技术中最常用的报告基因之一[9]。通过构建以绿色荧光蛋白为标记的转基因大丽轮枝菌可以动态检测大丽轮枝菌侵染棉花的进程，评估棉花发病症状出现之前棉花感染黄萎病的程度和进度。
本实验首先将GFP报告基因转化到大丽轮枝菌中，以检测大丽轮枝菌侵染程度和进程，在蘸根接种法和张书玲等建立的棉花黄萎病培养基定量接种法的基础上，以野生型大丽轮枝菌Vd991和转基因大丽轮枝菌Vdgfp5侵染陆地棉TM1，比较这两种接种方法在黄萎病抗性鉴定方面的差异，定期统计发病率并在荧光体视镜下观察棉苗组织切片的荧光现象；应用培养基定量接种法比较高抗黄萎病的海岛棉7124和感病品种TM1，探索培养基定量接种法在比较抗病和感病品种在黄萎病菌侵染过程差异方面的应用。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株 真菌表达载体1300HYGsGFP是在pcambia1300的基础添加真菌启动子和潮霉素抗性基因改造而成的。该载体组成型表达sGFP基因，以潮霉素抗性基因Hyg为选择标记，由江苏省农业科学院农业生物技术研究所张保龙研究员惠赠。大肠杆菌（E. coli）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105和LBA4404、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）落叶型黄萎病菌株Vd991和非落叶型中等致病力菌株BP2为
本实验室保存。
1.1.2植物材料 本研究选用对黄萎病敏感陆地棉遗传标准系TM1（Texas Marker1）和高抗黄萎病的海岛棉品种“海7124”为植物材料。
1.2方法
1.2.1 转基因大丽轮枝菌的获得和致病性鉴定 以含潮霉素为抗性筛选标记、绿色荧光蛋白 GFP 为报告基因载体真菌表达载体1300HYGsGFP转化农杆菌EHA105和LBA4404，并通过菌液PCR扩增GFP片段验证得到含重组质粒的农杆菌，将挑选的阳性农杆菌与大丽轮枝菌Vd991和BP2在IM共培养基上共培养60h后，转移至含有头孢噻肟钠和潮霉素B固体PDA培养基上，筛选挑取单克隆，通过CTAB法提取大丽轮枝菌的DNA，PCR扩增GFP片段，以验证阳性转化子。挑取少量菌丝于载玻片上，在荧光体视镜下观察转化子是否能够产生荧光，即获得有潮霉素抗性及GFP的转基因大丽轮枝菌。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1质粒和菌株3
1.1.2 植物材料4
1.2方法 4
1.2.1转基因大丽轮枝菌的获得和致病性4
1.2.2病原菌培养与孢子悬浮液的制备4
1.2.3蘸根接种法 4
1.2.4培养基定量接种法 4
1.2.3.3组织病理学切片及显微观察4
2结果与分析5
2.1转基因大丽轮枝菌的获得5
2.2转基因大丽轮枝菌的鉴定6
2.3蘸根法与培养基定量接种法的比较7
2.4培养基定量接种法的应用8
3讨论9
致谢10
参考文献10
棉花
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
黄萎病的抗性鉴定方法的研究
引言
引言
棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界范围内最重要的的经济作物之一，棉花纤维作为纺织业重要的原材料，对稳定国民经济有重要作用。黄萎病菌属于真菌的半知菌亚门淡色菌科轮枝菌属，属内有若干种，宿主范围很广，约600多种木本植物和草本植物都能受到黄萎病菌的侵染，包括番茄、辣椒、马铃薯、菊花、棉花、苜蓿、枫树等[1，2]。在棉花上造成危害的黄萎病菌主要是黑白轮枝菌（Verticillium alhoatrum Reinke & Berth.）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）[3]。被称为棉花“癌症”的棉花黄萎病是一种土传性维管束系统病害，主要通过棉花根部入侵，并进一步在棉花植株的维管束系统内定殖和扩展，引起棉花叶片失绿变黄，萎蔫脱落，严重时造成植株死亡，严重威胁棉花产量及纤维品质，是制约绵花稳产高产的主要因素[4]。
棉花黄萎病于1914年在美国弗吉尼亚州发现，目前己遍及美国、中国、印度、乌兹别克斯坦、巴西、澳大利亚、乌干达、南非等几十个国家。1935年在引进美国斯字4B棉种时传入我国，大量研究显示我国的棉花黄萎病病原菌属于大丽轮枝菌[5]。20世纪五六十年代棉花黄萎病在南北方棉区迅速蔓延，造成棉花大面积减产，纤维品质下降[6] .；到了90年代，“落叶型”黄萎病在各棉区普遍发生，造成了1993、1995和1996年连续3年的全国性大爆发；2012年强致病力的黄萎病菌株已在全国各产棉省广泛分布[4]。棉花黄萎病已成为阻滞我国棉花产量增加和品质提高的最重要的因素之一，对其的防治迫在眉睫。由于大丽轮枝菌的变异性强，在与寄主的协同进化过程中受环境变化、人为因素等多种因素的影响，常会产生生理分化，出现新的致病类型[7]，且国内的棉花生产多位小户型种植模式，品种更换频繁，同一田块中可能有多种不同生理型黄萎病菌，为棉花黄萎病的防止带来新的难题。因此棉花黄萎病的防治一直是棉花生产上的难题。
由于缺乏有效的化学防治方法，利用和选育抗病品种是防治棉花黄萎病这种土传病害的最经济有效的方法［8］。但由于陆地棉抗黄萎病资源缺乏、及田间抗病性鉴定结果受多种环境因素影响，传统育种方法选育抗黄萎病品种进展缓慢。随着植物抗病分子生物学和遗传学的发展，运用现代基因工程技术进行抗病分子育种的条件已趋于成熟，但仍需更加深入理解植物抗黄萎病的机制，找到调控机制中的关键因子，为棉花抗病分子育种提供候选基因［4］。抗病品种的利用选育以及抗病基因的鉴定有赖于能够实时、动态、准确观测和鉴定大丽轮枝菌侵染棉花的进程以及棉花感染程度和发病程度的实验方法。目前广为接受和应用的棉花黄萎病抗性的鉴定方法是营养钵蘸根接种鉴定法、针刺接种鉴定法或其他类似方法，这类伤根接种法通过认为制造伤害使病性快速侵入，然后通过评估棉花幼苗的发病程度实现快速鉴定。但由于伤根程度很难做到标准化，因此，单株鉴定结果一致性和准确性较差，另外，依赖发病程度很难鉴定发病症状出现之前棉花对大丽轮枝菌的抗侵入和抗扩展的能力。因此，寻找一种快速而准确的抗病鉴定方法是棉花黄萎病理论研究和抗性育种的关键步骤。
近年发展起来的绿色荧光蛋白（GFP）标记系统和荧光显微技术是研究寄主植物与病原菌互作的重要方法。绿色荧光蛋白（GFP)是由Shimomura等在1962年从水母中分离纯化的一种在蓝光或紫外光激发下产生绿色荧光的蛋白质。由于GFP的编码序列仅约717bp，转化效率较高，在不同种属细胞中各个部位均能组成型表达，并在大量表达情况下对细胞正常生长及功能没有毒性，可直接在荧光显微镜或紫外光下可检测，是目前DNA重组技术中最常用的报告基因之一[9]。通过构建以绿色荧光蛋白为标记的转基因大丽轮枝菌可以动态检测大丽轮枝菌侵染棉花的进程，评估棉花发病症状出现之前棉花感染黄萎病的程度和进度。
本实验首先将GFP报告基因转化到大丽轮枝菌中，以检测大丽轮枝菌侵染程度和进程，在蘸根接种法和张书玲等建立的棉花黄萎病培养基定量接种法的基础上，以野生型大丽轮枝菌Vd991和转基因大丽轮枝菌Vdgfp5侵染陆地棉TM1，比较这两种接种方法在黄萎病抗性鉴定方面的差异，定期统计发病率并在荧光体视镜下观察棉苗组织切片的荧光现象；应用培养基定量接种法比较高抗黄萎病的海岛棉7124和感病品种TM1，探索培养基定量接种法在比较抗病和感病品种在黄萎病菌侵染过程差异方面的应用。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株 真菌表达载体1300HYGsGFP是在pcambia1300的基础添加真菌启动子和潮霉素抗性基因改造而成的。该载体组成型表达sGFP基因，以潮霉素抗性基因Hyg为选择标记，由江苏省农业科学院农业生物技术研究所张保龙研究员惠赠。大肠杆菌（E. coli）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105和LBA4404、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）落叶型黄萎病菌株Vd991和非落叶型中等致病力菌株BP2为
本实验室保存。
1.1.2植物材料 本研究选用对黄萎病敏感陆地棉遗传标准系TM1（Texas Marker1）和高抗黄萎病的海岛棉品种“海7124”为植物材料。
1.2方法
1.2.1 转基因大丽轮枝菌的获得和致病性鉴定 以含潮霉素为抗性筛选标记、绿色荧光蛋白 GFP 为报告基因载体真菌表达载体1300HYGsGFP转化农杆菌EHA105和LBA4404，并通过菌液PCR扩增GFP片段验证得到含重组质粒的农杆菌，将挑选的阳性农杆菌与大丽轮枝菌Vd991和BP2在IM共培养基上共培养60h后，转移至含有头孢噻肟钠和潮霉素B固体PDA培养基上，筛选挑取单克隆，通过CTAB法提取大丽轮枝菌的DNA，PCR扩增GFP片段，以验证阳性转化子。挑取少量菌丝于载玻片上，在荧光体视镜下观察转化子是否能够产生荧光，即获得有潮霉素抗性及GFP的转基因大丽轮枝菌。
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